全球非酒精性脂肪肝病（NAFLD）及其更严重的形式非酒精性脂肪肝炎（NASH）的患病率逐年攀升，但目前尚无获批的药物用于治疗。NASH药物开发的一个主要障碍是临床前研究难以转化为安全且有效的临床结果，而这也强调了确定新的靶向途径的必要性。此前研究已发现甘氨酸代谢失调是NASH的病因和潜在的治疗靶点。

2023年4月10日，西安交通大学刘恩岐教授、密西根大学陈育庆教授、张继锋副教授及北京大学郑乐民教授共同通讯在Cell Metabolism（IF=31.373）在线发表了题为“DT-109 ameliorates nonalcoholic steatohepatitis in nonhuman primates”的研究论文，该团队开发了一种具有高度转化性的临床前的非人类灵长类动物NASH模型，通过多组学技术（转录组学、蛋白质组学、代谢组学和宏基因组学），该研究发现DT-109不仅通过刺激脂肪酸降解和谷胱甘肽形成（与小鼠相似），还通过调节微生物胆汁酸代谢，逆转肝脏脂肪变性并防止纤维化进展。（麦特绘谱为本研究提供胆汁酸谱检测分析服务）

该团队在此前的研究中通过使用NAFLD和NASH小鼠模型，确定了一种基于甘氨酸的三肽（Gly-Gly-Leu）–DT-109，通过诱导脂肪酸（FA）降解和通过新生谷胱甘肽（GSH）生物合成的抗氧化防御来降低脂肪性肝炎和肝纤维化。为了提高DT-109在临床试验中成功的概率，本研究评估了DT-109的剂量反应，并测试了其在非人类灵长类动物（食蟹猴）中的有效性和安全性，灵长类动物模型在组织学和转录上能够在最大程度上模拟人类疾病。

研究思路与结果

1. DT-109对NASH小鼠模型的作用

构建NASH小鼠模型，给予小鼠不同剂量DT-109处理，持续12周，以饮水为对照组。24周后发现，NASH组小鼠体重均显著升高，而DT-109治疗减弱了由NASH饮食引起的肝脏肿大，并呈剂量依赖性下降，以剂量最高（450 mg/kg/day）效果最为明显。相应地，循环转氨酶水平也呈剂量依赖性降低，肝纤维化和肝炎得到了显著缓解。

图1. DT-109以剂量依赖的方式改善小鼠非酒精性脂肪性肝炎

2. 构建NASH非人类灵长类动物模型模拟人类疾病

本研究利用食蟹猴进行饮食干预构建NASH模型。从1000多只猴子中筛选NASH易感者，其中69只公猴被选择进行体征、生化及组织学分析，进一步将无NAFLD相关病理学或未发展成NASH的猴子排除，最终20只NASH猴子模型纳入进行后续研究。喂以研究团队新开发的NASH饮食，10个月后进行有效性和安全性评估，通过相关指标及肝脏转录组学数据比较分析，确认该模型可以在很大程度上模拟人类疾病。

在进行NASH喂食时给予DT-109处理，剂量为150 mg/kg/day，另以饮水为对照组。肝脏损伤分析发现，DT-109治疗的猴子AST和ALP显著降低。肝脏形态、纤维化、肝脏脂肪变性等指标都得到有效改善。因此，DT-109可通过逆转肝脏脂肪变性和抑制炎症和纤维化进展，来改善非人类灵长类动物的NASH表型。

图2. 食蟹猴NASH模型构建

3. 多组学分析DT-109的潜在作用机制

① 首先对试验终点收集的肝脏进行RNA测序，分析显示Top100的DEGs中，调节促炎和免疫反应的关键基因(如TREM2、CCL18、LAT2和SLAMF7)以及纤维发生和ECM重塑的关键基因(如TIMP1、COL16A1、MMP14、CTHRC1和ITGA11)显著下调，而能量和脂肪酸（FA）代谢的主要调节因子PPARGC1A和其他调节FA和胆固醇代谢的基因(如CYP1A2)在DT-109治疗后显著上调。此外，NASH中被抑制的甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路以及色氨酸代谢通路，在使用DT-109治疗的猴子肝脏中显著上调，同时上调FA降解通路；细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号通路和ECM受体作用受到抑制，局部黏附和细胞黏附分子途径下调。

② 为确定NASH期间观察到的转录改变是否转化为DT-109保护作用的功能过程，研究团队对肝脏进行无偏蛋白质组学分析发现，转录组和蛋白质组数据的通路富集分析结果相似。进一步通过组织学和生化方法证实了这些改变通路的结果。这些数据表明，DT-109诱导FA降解，并抑制非人类灵长类动物NASH的促炎和纤维化反应。

图3. 肝脏转录组学和蛋白质组学分析揭示

③ 非靶向代谢组学分析显示两组猴子的血清代谢谱明显区分，胆汁酸（BA）通路富集最为显著，DT-109治疗使循环BAs总体减少，其中下调最多的胆汁酸是次级BA，石胆酸LCA（具有肝毒性）及其甘氨酸结合型GLCA和牛磺酸结合型TLCA。进而对胆汁酸谱进行靶向定量分析，证实了循环LCA显著降低（68.3%，p=0.0007），以及总循环BAs显著降低，其中次级BAs下降最显著。小鼠中也发现了类似结果。

图4. 非靶向和靶向代谢组学揭示了DT-109抑制胆汁酸代谢

④ 进一步探究DT-109调节LCA代谢的潜在机制，研究团队对猴子肝脏和粪便进行非靶向代谢组学和靶向代谢组学分析，以及粪便宏基因组学。尽管PCA和OPLS-DA显示两组代谢谱差异明显，但总BAs、初级BAs和次级BAs无显著差异。因此，研究团队进行猴子粪便胆汁酸谱定量分析（麦特绘谱提供检测服务），结果显示LCA浓度最高，DT-109处理后显著降低。进一步16S rRNA测序分析发现，DT-109改变了肠道菌群组成，特别是Escherichia Shigella, Prevotella 7等下调，Phascolarctobacterium, Faecalibacterium等上调。

随后对这些改变的菌群与NASH相关指标和LCA浓度进行相关性分析，确定与NASH严重程度和LCA代谢相关的细菌。其中E. Shigella（先前报道在NAFLD和肝纤维化患者中较高）与血清AST、NAS、纤维化评分以及肝脏LCA呈最显著的正相关；相反，Faecalibacterium（以抗炎和降低小鼠肝脏脂肪变性而出名）与血清AST、NAFLD活动性评分（NAS）、纤维化评分和肝脏LCA呈最显著的负相关。上述结果表明，在NASH期间使用DT-109治疗可调节与LCA代谢和NASH严重程度相关的肠道微生物群。

图5. DT-109改变与LCA相关的肠道微生物群

4. 明确DT-109是否通过调节肠道微生物来抑制LCA的产生

首先，独立的qPCR分析证实，DT-109处理后粪便中产丁酸菌Faecalibacterium prausnitzii显著上调，而Escherichia Shigella显著下调。随后，使用同位素标记的CDCA（LCA的前体）评估LCA的微生物合成，小鼠粪便与d4-CDCA共同培养，分别不添加或添加不同浓度的DT-109（0-500μM/L），并用质谱检测d4-LCA水平，结果显示，DT-109处理剂量依赖性地减少了LCA的产生（最高达53.3%）。进一步将小鼠粪便与d4-CDCA共同培养，并分别添加F. prausnitzii或等体积的GAM培养基（对照组），进行24h的监测，发现F. prausnitzii从4h开始显著减少LCA的生成。

最后，研究团队对临床样本（149例NAFLD和229例健康对照）的循环LCA进行分析，与此前多项研究结果表明的LCA与NAFLD严重程度及其肝毒性呈正相关和本研究中非人类灵长类动物结果一致，NAFLD患者循环LCA显著升高。并且在年龄和性别调整后，循环LCA与NAFLD风险呈正相关，进一步调整甘油三酯后，LCA升高也被发现是NAFLD的独立预测因子，再进一步调整空腹血糖和高密度脂蛋白胆固醇后，相关性仍然显著。因此，DT-109调节肠道菌群以增加F. prausnitzii，从而抑制具有肝毒性的LCA的产生。

图6. DT-109抑制微生物产生LCA，而LCA在NAFLD患者中增加

小结

基于该团队前期发现，本研究证明了DT-109在临床上的治疗潜力：1）使用非人类灵长类动物和各种小鼠和细胞培养模型发现DT-109治疗是安全的，在体内和体外测试的所有剂量下都没有毒性作用。2）虽然NAFLD与肝脏相关死亡风险增加相关，但NAFLD患者最常见的死亡原因是动脉粥样硬化性心血管疾病，迄今为止，最前沿的NASH候选药物奥贝胆酸可加剧动脉粥样硬化性血脂异常，与之不同的是，DT-109具有心脏保护作用。3）这项研究表明，DT-109通过诱导肝脏FA降解和GSH生物合成以及调节微生物BA代谢等多种机制来改善NASH，这与NASH复杂的发病机制和靶向多途径的必要性是一致的。因此，无论是作为单一疗法还是与其他候选药物联合治疗方案，DT-109在NASH中的治疗潜力值得下一步临床评估。

参考文献

1. Qu et al., DT-109 ameliorates nonalcoholic steatohepatitis in nonhuman primates. Cell Metabolism. 2023.

2. Rom, O., et al. Glycine-based treatment ameliorates NAFLD by modulating fatty acid oxidation, glutathione synthesis, and the gut microbiome. Sci. Transl. Med. 2020.

3. Rom, O., et al. Induction of glutathione biosynthesis by glycine-based treatment mitigates atherosclerosis. Redox Biol. 2022.

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本研究粪便胆汁酸靶向定量代谢组由麦特绘谱提供检测服务。胆汁酸作为一类具有特殊生理作用的小分子，近年来被证实参与机体多项重要的生理生化过程，并在多种疾病的发生发展中起关键作用。针对胆汁酸谱，麦特绘谱拥有两套绝对定量检测方法：胆汁酸简谱和65+种胆汁酸全谱。目前已协助客户在Cell Metabolism, Diabetes Care, Nature Communications, Advanced Science, Science Advances, Microbiome等国际学术期刊发表40余篇胆汁酸相关研究成果，平均IF>9。

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