大量肠道菌群队列研究表明肠道微生物与宿主的健康与疾病状态存在潜在的因果关系，已有充分证据证实肠道共生菌能够通过脱羟基化作用将初级胆汁酸转化为次级胆汁酸DCA和LCA，但更多的次级代谢产物尚未被发现，而这些代谢物在疾病及健康状态下的功能也有待研究。

2024年初，微生物技术国家重点实验室刘双江教授团队与合作单位团队在Nature Microbiology上发表了题为“Gut commensal Christensenella minuta modulates host metabolism via acylated secondary bile acids”的研究论文，揭示小克里斯滕森氏菌Christensenella minuta等肠道共生菌通过产生新型次级胆汁酸——3-O-酰基胆酸，从而靶向肠-肝信号轴调控宿主糖脂代谢的新机制，并证明C. minuta及酰基胆酸具有治疗II型糖尿病等慢性代谢类疾病的应用潜力。

相关阅读：客户案例 | Nature Microbiology新型胆汁酸揭秘：肠道共生菌调控糖脂代谢新机制

2024年9月12日14:00，麦特绘谱特邀本篇研究第一作者刘畅研究员做客绘谱学堂，带来关于《基于培养组学的肠道新功能菌发现与机制研究》的主题报告，为各位科研同仁分享此篇文章背后的研究故事。欢迎大家相约直播间，会后特设答疑环节，线上一起探讨研究热点、交流科研观点。

主讲嘉宾

刘畅  研究员

山东大学微生物技术研究院

国自然优秀青年基金获得者、泰山学者青年专家、齐鲁青年学者；博士毕业于中国科学院大学，先后在中国科学院微生物研究所和山东大学从事科研工作。担任iMeta，Engineering Microbiology等杂志青年编委；任中国生物物理学会肠道菌群分会秘书组成员、中国生理学会人体微生态专业委员会委员、中国微生物学会微生物组专业委员会委员。主要从事肠道微生物培养组学、肠源新功能菌发掘与机制研究，相关成果以一作/通讯（含共同）在Nature Microbiology, Nature Metabolism，Nature Communications等杂志发表。

课后答疑环节交流热烈，探讨了诸多学术问题，现将相关内容整理如下，方便大家翻阅。

01. 培养组学：样品采集和前处理，培养基与培养条件设计，菌群高通量分离具体怎么做的？

A: 首先，样品的采集需要遵循严格的操作规程，以确保样品的代表性和无污染。随后，前处理步骤根据样本类型和研究目的的不同而具有高度的特异性。对于定向组学而言，前处理条件往往需要经过多次摸索和筛选，可以参考前人研究的大量文献。

在选择最初的培养条件时，针对不同类型的临床样本，如粪便等，存在着一些常规的培养基组合。例如，对于粪便样本的分离培养，改良GAM和BHI等培养基是文献中广泛使用的选择。这些初始培养基的选择基于其广谱性和对多种肠道微生物的适应性。然而，具体的培养条件（如温度、pH值、气体环境等）仍需根据实验需求进行调整和优化。

在确定了初始培养条件后，通常会进行预实验，以评估不同培养基和条件对菌群分离的影响。接下来，根据预实验结果，调整培养条件、挑菌的周期和频率等具体参数，以达到最佳的分离效果和研究目的。

02. 开展培养组学针对不同类型的临床标本如何选择最初的培养条件？有常规的一些培养基组合吗？

A: 在开展培养组学研究时，针对不同类型的临床标本选择最初的培养条件是一个关键步骤。在选择最初的培养条件时，针对不同类型的临床样本，如粪便等，存在着一些常规的培养基组合。例如，对于粪便样本的分离培养，改良GAM和BHI等培养基是文献中广泛使用的选择。这些初始培养基的选择基于其广谱性和对多种肠道微生物的适应性。然而，具体的培养条件（如温度、pH值、气体环境等）仍需根据实验需求进行调整和优化。需要综合考虑实验的具体情况和目标，以确保成功获得目标菌种。

03. 临床标本做厌氧培养，标本如何保存和运输到实验室？

A: 对于新鲜样本的分离培养，通常要求在粪便样本采集后4小时内送达实验室，并迅速转移至厌氧操作箱中，以确保样本在最佳条件下进行分离培养。这样的操作流程能够最大程度地减少外界因素对样本的影响，从而保证分析的准确性和可靠性。

此外，我们也进行了实验探索，尝试从存储在-80℃冰箱中的粪便样本中分离微生物。实验结果显示，只要这些样本在采集后得到及时且恰当的冻存处理，并且避免了反复冻融过程，其分离效果虽然可能略逊于新鲜样本，但仍然是可接受的。

04. 单菌灌胃的模型动物选的是无菌动物（Germ Free）么，如果是SPF小鼠，如何排除肠道固有其它菌对目标灌胃菌的影响呢？

A: 在当前的实验设计中，我们主要采用的是普通的SPF（无特定病原体）小鼠作为单菌研究的对象。然而，在探讨更为深入的生物学机制，特别是当我们希望精确解析某一特定信号通路的作用时，无菌动物模型可能会成为我们后续研究的选择。

关于SPF（无特定病原体）小鼠在肠道菌调控药物代谢研究中的应用，我们实际上并不刻意排除肠道内其他固有细菌对目标灌胃菌的影响。在进行单菌定植实验时，我们的目标并非仅聚焦于某一特定菌株的直接靶点，而是更广泛地探索其在肠道菌群整体环境中的表现及其与健康或疾病状态的关联性。由于肠道菌群的复杂性，许多细菌的功能表现可能是通过调节整个菌群结构而间接实现的。因此，我们倾向于在保留自然菌群环境的前提下，同时观察目标菌株是否通过影响菌群间接影响宿主。在SPF小鼠模型中，尽管它代表了较为纯净的实验条件，但我们仍认为这是一个贴近实际但不完全脱离现实情况的模型，它允许我们在控制一定变量的同时，观察目标菌株在复杂肠道环境中的行为。

05. 单菌灌胃的剂量、周期和频率是怎么确定的呢？

A: 在单菌灌胃实验中，确定剂量、周期和频率是确保实验效果的关键步骤。一般而言，我们的目标是确保目标菌株在宿主体内达到并维持一个稳定的相对高峰度。因此，在选择灌胃剂量时，我们通常会参考大量相关文献，特别是针对肠道共生菌的干预研究。在这些研究中，灌胃剂量大多集中在每只动物10^8~10^9 CFU的范围内，这个剂量范围被认为能够达到评估单菌功能的目标。

至于灌胃的周期和频率，它们可能因实验模型、观察目标及具体研究需求的不同而有所差异。在某些情况下，为了维持菌株在肠道内的高峰度，可能需要每天进行灌胃。然而，这并非一成不变的规则，而是需要根据实验的具体情况进行调整。

总的来说，如果实验模型并非特别新颖，且研究内容已有一定的文献基础，那么参考可信度较高的前人文献来确定灌胃的剂量、周期和频率是一个较为稳妥的方法。这不仅可以提高实验的可重复性，还能在一定程度上减少摸索条件所需的时间和资源。

06. 单菌培养添加底物共培养时，底物只在DMSO等有机溶剂中完全溶解，但DMSO对菌有抑制作用，请问这种有什么好的解决方法吗？

A: 一般采取的策略是尽量降低DMSO在培养基中的最终浓度。由于DMSO是许多底物溶解所必需的有机溶剂，但其对菌的生长确实可能产生不利影响，因此控制DMSO的浓度至关重要。

通常情况下，我们会将DMSO在培养基中的最终浓度控制在1%左右，这个浓度下其对菌的影响可能不是特别显著，可以被认为是相对安全的。当然，具体的可接受浓度还需根据实验菌种的敏感性和实验目的来确定。

如果实验条件允许，我们会尽量寻找替代溶剂或优化底物的溶解方法，以减少DMSO的使用量。然而，在无法完全避免使用DMSO的情况下，我们会确保将其浓度控制在尽可能低的水平，以减轻对菌生长的不良影响。

07. 目前做的研究课题是关于菌对于癌症相关作用的研究，但因为没有途径拿到临床粪便样本，目前的实验只是在裸鼠体内进行灌胃操作并取粪便测序，请问裸鼠的菌的调控和人体的菌具有相互参考价值吗？

A: 人和裸鼠的肠道菌群物种组成有显著差异，模型动物的菌群组成无法完全代表人肠道的微生物组成；但是肠道微生物的功能具有高度的冗余性，这意味着不同物种的肠道菌可能在执行某些功能时展现出相似性。其次，在开展基于动物实验的研究时不能只局限于对动物模型肠道菌群进行研究和分析。当在动物模型中发现了新的功能机制或特征菌种时，可以进一步在人类队列中进行关联分析和验证。即使目前没有直接的临床粪便样本，也可以利用可公开获取的结直肠癌患者队列的肠道宏基因组数据进行分析，从中寻找相关性的线索，以支持动物实验的结果并验证其在人类中的普遍意义。

因此，尽管存在物种差异，但裸鼠肠道菌群的研究仍能为理解人体肠道菌群在癌症中的作用提供有价值的参考。同时，我们也将持续努力获取临床样本，以更直接地验证我们的研究成果。

08. 如何评估C. minuta在小鼠体内中的成功定植呢？

A: “成功定植”并不意味着CM一旦灌入小鼠体内就能永久稳定存在，因为外来微生物在宿主体内的定植受到多种因素的影响，难以达到绝对稳定的高丰度状态。

在我们的实验中，由于采用每天灌胃的方式给予CM，我们期望的是通过持续不断的输入，使小鼠体内能够维持一个相对于对照组而言较高丰度的活菌存在。为了评估这一效果，我们采用了绝对定量的qPCR方法，对处理组（接受CM灌胃的小鼠）和对照组（未接受灌胃的小鼠）进行检测。

具体而言，我们在灌胃后的不同时间点（如1小时和24小时，以及整个观察期间内的多个时间点）收集样本，并检测CM的丰度。通过比较处理组和对照组的检测结果，我们发现处理组小鼠体内CM的丰度在观察期间内保持相对稳定，尽管可能存在波动，但这些波动是重复的且始终高于对照组。基于上述观察结果，我们认为CM在小鼠体内的干预是有效的。

09. 这种新型胆酸的调控机制怎么在人体中做验证呢？

A: 首先，动物实验虽然为我们提供了一定的线索和初步证据，但由于人与动物在生理、代谢等方面的差异，这些结果并不能直接应用于人体。在人体实验中，我们无法像动物实验那样直接观察特定的生理过程，比如FXR是否受到抑制等。因此，我们主要通过检测血液等生物样本中的相关标志物（Biomarker）来辅助判断调控机制是否在人体内发生作用。这些标志物可以作为间接证据，帮助我们理解新型胆酸在人体内的调控效果。

然而，临床实验的主要目的并非单纯探讨机制，而是评估新型胆酸对人体的实际效果和安全性。即使动物实验显示出了积极的结果，也不能保证在人体中同样有效。因此，我们需要通过严谨的临床试验来验证新型胆酸在人体中的实际疗效和安全性。

10. 酰化的胆汁酸应该用什么方法检测？

A: 对于酰化胆汁酸的检测，如果采用常规的胆汁酸测定方法，可能会因为缺少相应的标准品而无法准确测定。这是因为定量胆汁酸代谢组分析在设计时，如果未将酰化胆汁酸纳入考虑，那么在检测过程中就可能不会包含针对这些特定化合物的检测条件或标准品。

检测酰化胆汁酸的方法在原理上与检测其他类型胆汁酸是相似的，都依赖于液相色谱-质谱联用技术（液质联用）。只要我们拥有酰化胆汁酸的标准品，并且优化好检测条件，那么就可以通过液质联用技术来准确地测定其在样品中的含量。

因此，如果需要检测酰化胆汁酸，建议首先确认是否具备相应的标准品，并咨询专业的代谢组学服务机构或实验室，以确保检测方法的准确性和可靠性。在具备标准品的前提下，液质联用技术将是一个有效的检测手段。

11. 请问你们用的胆汁酸，在酰基化前后，对FXR的活性有差异吗？

A: 对FXR（法尼酯X受体）的活性确实存在显著差异。胆酸本身被认为是FXR的一个弱激动剂，这意味着它能够在一定程度上激活FXR，但其效果相对较弱。然而，当胆酸经过酰基化修饰后，其性质发生了显著变化，转变为FXR的一个抑制剂。这种差异对于理解胆汁酸在生物体内的代谢调控机制以及开发相关药物具有重要意义。

12. 如果初级胆汁酸在模型小鼠血液里面可以检测到，是因为在肝脏循环代谢到血液里，还是肠道的初级胆汁酸到血液里呢？

A: 关于初级胆汁酸在模型小鼠血液中可检测到的原因，这主要涉及到肝脏和肠道的代谢过程。初级胆汁酸在肝脏中合成后，一部分会通过胆道系统排入肠道，以辅助食物的消化和吸收。然而，同时也有一部分初级胆汁酸会直接进入血液循环，参与全身的代谢活动。因此，当我们在模型小鼠的血液中检测到初级胆汁酸时，这既可能是由于肝脏循环代谢至血液的结果，也可能是肠道中的初级胆汁酸通过某种机制（如肠肝循环）重新进入血液所致。

13. 做代谢、测序的时候，请问粪便、血清、盲肠内容物应该怎么选择？

A: 在选择进行代谢、测序的样本时，通常会优先考虑盲肠内容物。这是因为盲肠内容物更直接地反映了肠道内部的微环境和代谢特征，对于研究肠道菌群及其代谢活动具有更高的代表性。除非在特定情况下，如盲肠内容物样本获取困难或不足时，我们才会考虑选择粪便样本作为替代。然而，需要注意的是，粪便样本虽然也能提供肠道代谢的部分信息，但其受环境因素影响较大，可能不如盲肠内容物准确。

另一方面，血清样本的采集则更多地关联于宿主本身的代谢状态和健康机制的研究。当我们需要探讨药物对宿主机体产生的整体影响，或者是在研究肠道菌群与宿主代谢相互作用的机制时，血清样本的代谢和测序就显得尤为重要。此时，我们可以将血清样本与盲肠内容物（或粪便样本）的代谢、测序结果进行对比分析，以全面理解药物或干预措施对宿主-肠道菌群代谢网络的影响。

14. 拿到单菌可以体外检测其参与的胆汁酸代谢或脂质代谢吗？

A: 关于单菌在体外条件下检测其参与的胆汁酸代谢或脂质代谢的能力，我认为这两者都是可行的，但各有其特点。胆汁酸代谢因其在水相和有机相中的相对稳定性，通常较为容易检测。相比之下，脂质代谢的体外检测可能需要更多的摸索，因为脂质在水相为主的培养基中的溶解性和稳定性是一个挑战。然而，从理论上讲，无论是胆汁酸还是脂质的体外转化与代谢，只要通过适当的实验设计和条件优化，都是可以在体外培养体系中进行检测的。因此，针对特定单菌的这两种代谢途径，我们可以根据实验目的和条件，选择合适的方法进行检测与分析。

15. 目前益生菌的功能基因（比如关键代谢物酶）挖掘都有哪些方法呢？

A: 可以首要基于基因组测序技术，获取益生菌的完整或接近完整的基因序列信息。接下来，利用不同的功能注释数据库和工具对测序结果进行注释，是当前较为普遍和有效的方法。由于存在多种功能注释的库和方法，每种方法都有其独特的优势和侧重点，因此建议可以尝试多种注释工具，以获得更全面的基因功能信息。

在获得一系列注释结果后，我们需要进行综合分析比较，通过整合不同来源的信息，初步筛选出可能与益生菌关键功能相关的基因，如代谢物酶基因。然而，值得注意的是，这种基于序列信息的预测仅能提供初步线索，真正的功能验证还需依赖于后续的具体实验。因此，在初步挖掘之后，设计并实施相应的实验方案，对候选功能基因进行验证，是不可或缺的步骤。

16. 请问C. minuta作为潜在益生菌治疗代谢性疾病的安全性和有效性如何评估？

A: 首先，我们最直接的步骤是选择具备相应资质的独立第三方机构，这些机构专注于益生菌或微生态药物的微生物评估。我们将委托这些机构对目标菌株在动物模型上的安全性进行全面评估，这包括但不限于急性毒性、慢性毒性、感染潜力以及遗传致畸性等方面的严格测试，以确保该菌株在动物实验中的绝对安全性。

进一步的，鉴于人体安全性的评估没有更为直接且普遍适用的替代方法，我们将致力于设计严谨的临床试验方案。通过精心策划的临床实验，我们将对目标菌株在人体内的安全性进行科学的评估与验证。这一步骤对于确保菌株在人体应用中的安全性至关重要。

17. 请问一下得到的单克隆有几千个，是怎么进行的统计呢？会对每一个单克隆进行鉴定吗，那具体是怎么鉴定呢？

A: 在我们的实验中，为了获得足够的分离株，我们通常会从原始样本中挑选超过预期数量的单克隆，比如当目标是一万多个分离株时，我们可能会挑选超过两万个单克隆。这是因为单克隆在培养过程中可能遇到多种问题，如无法成功生长成纯菌株或被污染，这些都可能导致最终获得的分离株数量少于预期。

为了确保每个分离株的纯度与准确性，我们对每一个挑选出的单克隆都进行了严格的鉴定。鉴定的主要步骤是测定其16S rRNA的全长序列（约1.5kb），这一序列作为细菌分类的重要依据，能够反映出菌株的种属信息。随后，我们将测得的序列与数据库中的已知序列进行比对，以确定该单克隆的大致分类。只有当单克隆的16S rRNA全长序列显示其为纯菌，我们才认定该单克隆为一个有效的分离株。

18. 宏基因组学分析出来的单菌，如果买商业化的菌种进行验证的话，需要买不同菌株吗？

A: 当考虑使用商业化的菌种进行进一步验证时，需要谨慎选择。因为宏基因组学揭示的差异可能源于物种间的多样性，而这种多样性背后往往蕴含着不同水平上的特异性功能。

即使是同一物种的不同菌株，也可能在功能上存在显著差异。这意味着，如果我们购买的商业化菌种并非直接来源于研究样本，那么该菌株可能并不具备我们在宏基因组学研究中观察到的特定功能。换句话说，我们观察到的差异可能是由于某种特定菌株的特定功能所导致的，而这种功能可能并不普遍存在于同一物种的其他菌株中。

因此，为了降低实验出现假阴性的风险，如果条件允许，建议尽可能多地尝试不同来源、不同菌株的商业化菌种进行验证。这样做不仅可以提高实验的可靠性和准确性，还有助于我们更全面地理解宏基因组学分析结果的生物学意义。

END