昼夜节律是许多生物体的生物行为和生理功能的周期性更替。昼夜节律紊乱会影响宿主的神经、代谢和免疫稳态，从而导致一系列神经退行性疾病、代谢疾病和癌症。同样的，肠道菌群也有自己的昼夜节律，小鼠的最新研究进展表明，肠道菌群的丰度、位置和功能经历昼夜节律波动，这受食物摄入时间和饮食成分控制，并有可能影响胃肠道和其他器官的细菌抗原和代谢物。然而，肠道菌群的时钟是否以及如何影响人类宿主的昼夜节律以及健康尚不清楚。来自中科院微生物所王军等团队确定了人类和小鼠肠道菌群中具有相同的昼夜节律特征，并探究了其中的关键代谢物甲硫氨酸对宿主的影响，相关成果发表于Protein & Cell。

菌群测序和代谢组检测

为了研究小鼠和人类肠道菌群中与节律相关的共同代谢特征，分别在早上10点钟和晚上10点钟收集10只小鼠粪便，进行菌群测序和代谢组分析。菌群结果显示，小鼠肠道菌群组成和功能表现出显著昼夜差异（图1A），夜间观察到的肠道菌群丰富度和均匀度有升高趋势（图S1A和S1B））。还发现，具有显著昼夜差异的标志物种是胆型螺旋杆菌(Helicobacter bilis)，具有显著昼夜差异的代谢通路有S-腺苷-L-甲硫氨酸循环通路I、甲基赤藓糖醇磷酸通路I、L-赖氨酸生物合成III和硒氨基酸生物合成通路（图1B）。结合作者最近的人的原位调查研究（该调查确定了具有昼夜节律振荡的细菌分类群和代谢途径），获得了人和小鼠共有的两条代谢通路，其中S-腺苷-L-甲硫氨酸循环通路I是唯一表现出相同模式的，即在白天活动的人类（白天）和夜间活动的小鼠（夜间）的清醒期，代谢活动增加，而在睡眠期则相反（图1C）。

代谢组学分析结果显示，小鼠在夜间（清醒期）共有24种粪便代谢物显著增加，包括L-甲硫氨酸、消旋甲硫氨酸和甲硫氨酸亚砜（图1D）。此外，8种代谢物显示出减少的趋势，例如N、N-二甲基鞘氨醇、N-甲基烟酰胺和鞘氨醇（图1E和S1C）。通路富集分析确定了14条代谢通路，其中2条受到昼夜循环的显著影响，其中甲硫氨酸代谢被列为最重要的通路（图S1D）。

图S1. 肠道菌群组成、功能和代谢物存在昼夜差异

甲硫氨酸处理上调时钟基因表达

为了研究甲硫氨酸对宿主昼夜节律的潜在影响，用100μmol/L甲硫氨酸处理常用的肠屏障功能模型Caco2细胞24h，并检测4个核心时钟基因的细胞表达，即BMAL1、CLOCK、NR1D2（核受体亚家族1D组成员2）和PER2（图1F）。mRNA结果显示，甲硫氨酸处理后这些基因的表达显著增加（图1G）。鉴于甲硫氨酸可以作为S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的前体作为膳食甲基供体，利用牛津纳米孔测序技术(ONT)对Caco-2细胞进行直接RNA测序(DRS)。然后，检测mRNA N6-甲基腺苷(m6A)和5甲基胞嘧啶(5mC)修饰（图1F），分别在对照载体和甲硫氨酸处理的Caco-2细胞中鉴定出1,572和3,302个显著的m6A修饰位点，其中共有位点是471个，且在甲硫氨酸处理组中m6A修饰位点数量增加（图1H）。在对照组和甲硫氨酸处理组中分别有69678和70317个5mC修饰位点，且共有位点是39307个（图1I）。这些修饰位点用于计算转录本的m6A和5mC修饰率（MR），甲硫氨酸处理的细胞中MR增加（图1H和1I）。

甲硫氨酸处理升高细胞甲基化水平

将转录本与基因比对，计算基因的MR，分别鉴定出900和2606个基因，且在甲硫氨酸处理组的细胞中m6A和5mC修饰水平增加。通过检索GO数据库，鉴定出m6A(29/900)和5mC(77/2606)水平增加的节律相关基因。且发现AHCY（腺苷高半胱氨酸酶）基因的m6A和5mC水平增加，已报道其蛋白质产物对于周期性H3K4三甲基化和BMAL1向染色质的募集至关重要并促进随后的昼夜节律转录活动。同样，在甲硫氨酸处理的细胞中也观察到AHCY的表达上调（图1J）。总之，甲硫氨酸可以调节人体肠道细胞的时钟基因表达，增加细胞整体甲基化，对整体节律相关基因产生重塑作用，其中增加的mRNA甲基化水平和AHCY基因mRNA的积累可能是一个机制。

甲硫氨酸处理降低细胞活性氧水平

据报道，昼夜节律紊乱（睡眠剥夺；SD）的另一个重要后果是肠道活性氧（ROS）的积累，这是一种导致细胞氧化损伤和坏死的有害物质。也有报道指出，肠道菌群可能会调节SD诱导的炎症反应和认知障碍。鉴于甲硫氨酸是一种还原性氨基酸，随后研究了它对ROS的影响。与对照组相比，在甲硫氨酸处理的Caco-2细胞中检测到ROS水平显著降低（图1K）。然而，对于三种抗氧化酶，包括超氧化物歧化酶1(SOD1)、超氧化物歧化酶1(SOD2)和过氧化氢酶，western结果显示，甲硫氨酸并未显著增加它们的细胞内水平（图1L）。因此，甲硫氨酸可作为直接抗氧化剂降低细胞活性氧。

图1. 具有昼夜波动识别的关键肠道菌群代谢物及其对 Caco-2 细胞的影响

补充甲硫氨酸降低SD小鼠的血清皮质酮水平

接下来，在睡眠剥夺(SD)小鼠模型中测试了甲硫氨酸的抗氧化活性。设置四个分组：一组具有正常饮食和睡眠-觉醒周期（正常）的对照组，以及三组不同饮食甲硫氨酸处理（0%、0.86%、1.36%，分别对应：0，中和高Met）的SD组，在限制室中进行三天的SD干预（图2A）。结果显示，尽管饮食摄入量增加，但体重显著下降，特别是对于无Met的SD组（图2B）。此外，血清皮质酮，一种已知的昼夜节律调节剂，在SD组中显著增加，而甲硫氨酸补充剂降低了血清皮质酮循环水平，表明甲硫氨酸具有逆转SD诱导的皮质酮增加的潜力（图2D）。

补充甲硫氨酸降低SD小鼠肠道ROS水平

通过二氢乙锭(DHE)染色分析肠道ROS水平，结果显示，与正常组相比，中等Met的SD组的小鼠肠道ROS水平显著增加，与之前的报告一致。此外，SD干预后，不同甲硫氨酸水平对肠道ROS水平影响不同，其中富含Met组的ROS显著降低，而喂食无Met食物的小鼠的ROS水平增加（图2C）。此外，分别检测肠道、肝脏和大脑的H₂O₂水平，结果表明，在除了大脑之外的受检组织中，膳食甲硫氨酸的作用模式与小肠中ROS的作用模式相似（图2E）。因此，甲硫氨酸无论在体外还是体内都可以作为一种强大的抗氧化化合物。

补充甲硫氨酸降低SD小鼠炎症相关基因表达

鉴于SD报告的其他有害影响，随后研究了甲硫氨酸的影响。在小鼠小肠、肝脏和血细胞中进行了转录组测序。结果显示，与正常组相比，SD组肠道中等Met的一些昼夜节律基因的表达增加，包括Per2、Per3和Dbp（D-box结合PARbZIP转录因子）。通路富集分析表明，SD小鼠的小肠中与昼夜节律相关的生物学过程上调（图2F）。膳食甲硫氨酸限制则导致SD小鼠中与血管舒张相关的基因表达增加，而甲基化的相关基因减少。此外，在循环血细胞中，无Met的SD组（肠道中ROS水平最高）的炎症信号显著增加，如细胞对粒细胞巨噬细胞的反应、趋化因子生物合成过程和细胞因子生物合成过程。同时，补充甲硫氨酸会下调这些组织中与黏膜免疫反应和先天免疫反应等功能相关的基因，这表明甲硫氨酸可能会减少SD诱导的全身炎症，与ROS的中和作用可能是相关的。

补充甲硫氨酸改善SD小鼠肠道菌群失调

此外，宏基因组分析表明SD诱导的肠道菌群失调，与之前的报告一致，其组成和功能显著改变，包括一些有益菌，如假长双歧杆菌的丰度显著降低；有害菌，如甲型流感病毒和Dorea spp增加。此外，潜在有害菌，如鼠乳杆菌（据报道与肠道生态失调和生物素缺乏有关），以及几种已知的病原体包括鼠骨肉瘤病毒、小鼠乳腺肿瘤病毒和肺炎支原体，在无Met的SD组中显著富集（图2G和2H）。然而，这些菌随着甲硫氨酸的补充而减少。而有益菌（如狄氏副拟杆菌 Parabacteroides distasonis，据报道可改善肥胖和代谢功能障碍），以及Oscillibactersp.1_3的相对丰度，随着甲硫氨酸的补充而显著增加（图2H)。同时，肠道菌群的代谢活动也显示出各组之间的显著变化。总之，甲硫氨酸具有保护或恢复肠道菌群免受SD引起的生态失调的额外潜力。

图2. 甲硫氨酸对睡眠剥夺小鼠模型的保护作用

小结

本研究从人和小鼠共有的代谢通路和具有小鼠和人类昼夜模式的代谢物中确定了关键的肠道菌群代谢物甲硫氨酸，且发现甲硫氨酸代谢是小鼠体内受昼夜循环影响最大的菌群功能；补充甲硫氨酸可显著增加Caco-2细胞中昼夜节律基因的表达。从机制上讲，补充甲硫氨酸增加了整体甲基化水平，以及一个至关重要的特定基因AHCY水平。随后通过膳食甲硫氨酸处理探究SD小鼠模型中甲硫氨酸的作用，揭示了它具有中和SD诱导的ROS并减轻与SD相关的炎症和肠道菌群失调的多重影响，在治疗常见的睡眠剥夺和随之而来的不良反应方面具有很高的药物应用潜力。

参考文献

Gut microbial methionine impacts circadian clock gene expression and reactive oxygen species level in host gastrointestinal tract. Protein&Cell. 2022.

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本研究通过粪便代谢组学以及通路分析聚焦到关键的肠道菌群代谢相关的甲硫氨酸通路及其调控的病理生理作用。粪便（肠内容物）中微生物-宿主共生代谢物含量丰富，已被证明与多种疾病的发生发展及预后密切相关。麦特绘谱拥有业内强大的Q600全定量代谢组、Q300全定量代谢组、Q200宏代谢组以及菌群相关的16S rDNA测序和宏基因组等方法，适用于包括粪便（肠内容物）样本在内的多种生物样本分析，并提供代谢组学一站式整体解决方案，独家的检测技术、全面的数据报告以及专业的售后探讨，助力您的科研探索之路不断创新和突破。详情欢迎咨询麦特绘谱热线400-867-2686，获取详细资料！

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