2020年3月11日绘谱学堂第四期公开课–《病理生理条件下的肠道益生菌代谢研究策略》由上海交通大学系统生物医学研究院王晓艳老师主讲，本期公开课王老师从肠道菌群的研究热点出发，介绍益生菌代谢产物的分类和分析测定，探讨了益生菌代谢产物与宿主细胞功能之间的联系，阐释肠道微环境和益生菌之间的代谢互相作用，对最新益生菌研究结果进行归纳总结，梳理如何从代谢角度切入到肠道菌群研究。参加本次课程的老师和同学们认真听讲并踊跃提问与交流。在此，小编特别整理了一份课后Q&A分享给大家，以便您随时温习查阅。

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Q&A

Q1. 采用LC-MS可以测短链脂肪酸吗？

A1：GC-MS检测短链脂肪酸较为常见 ，但受限于GC-MS检测的短链脂肪酸种类很少，2018年麦特绘谱团队开发了LC-MS检测SCFA方法，可绝对定量检测乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、2-甲基丁酸、异戊酸、戊酸、己酸、异己酸、3-甲基戊酸、2-甲基戊酸、3-羟基异戊酸。

Q2. 哪些肠道菌群代谢物可以定量呢？

A2：理论上只要能拿到代谢物标准品，都可以进行定量，目前我们的菌群代谢物绝对定量检测数量已扩展到200种，涵盖短链脂肪酸、色氨酸、支链氨基酸、芳香酸代谢物和胆汁酸等。

Q3. 目前大家都在关注肠道菌群如何调控代谢，以及环境因素通过影响某种菌群丰度调控代谢，具体如何影响菌群有哪些机制呢？ 

A3：宿主和菌群的影响是双向的，比如菌群可以保护宿主的肠道免疫稳态，而宿主分泌的免疫蛋白也可以促进特定肠道细菌的肠道定植。

Q4. 无论菌群还是代谢物都不能停留在发现阶段，都要进行验证其功能性，有什么方法可以了解升高或者降低的菌和这个疾病机制相关？

A4：首先需要结合大量文献、数据库和经验来筛选；其次推荐联合代谢组学研究，探索肠道菌和宿主的相互作用。

Q5. 短链脂肪酸测定，选肠道内容物还是粪便？测短链脂肪酸样品怎么保存？ 

A5：肠道内容物和粪便 都可以，根据研究目的进行选择。如果同时开展菌群测序，就和测序样本类型保持一致，保存方法为低温冻干-80℃保存或直接-80℃保存。

Q6. 关于菌群代谢产物分析，目前主要集中在大家比较共识的代谢物，比如短链脂肪酸，色氨酸？

A6：代谢物研究主要分为两种，一种是做已知代谢物的新功能，典型如胆汁酸在多囊肿卵巢综合症中的作用；一种是发现新的功能物质，如咪唑丙酸。

Q7. 菌群与代谢物相关性研究方面，贾伟老师团队开发GRaMM关联分析方法，目前该方法是否成熟？

Q7：该方法已在多个数据集中进行了测试，与现有其他方法相比，该方法可以识别出更多的关联对，尤其是非线性的关联对。该方法目前作为初筛方法使用。

Q8. 菌群分析中，怎么查询对应的代谢通路或表型？ 

Q8：现在宏基因组的结果中有通路分析的; 一般测序公司都会采用Picrust或者Tax4Fun做菌群的通路和表型预测。

Q9.  肠道内容物通常选择哪一段？空肠，回肠，盲肠，结肠？

Q9：小鼠一般选用盲肠内容物，因为这一部分样本可以同时保证16S和代谢检测用量。具体肠段选择要根据研究目的选择，比如胆汁酸在回盲部位重吸收可以选择回盲部进行研究。

Q10. 鉴定出来的差异代谢物是属于肠道菌群代谢的产物还是宿主产生的代谢物，这个能区分吗？

Q10：目前不能区分，而且大多是共代谢物，如果想要区分可以采用同位素示踪，或者体外验证。目前没有数据库能够实现区分，需要后期实验去验证是宿主代谢还是菌群代谢或者是两者共代谢。

Q11.  代谢组学分析出68种差异代谢物，如何缩小差异代谢物？

Q11：代谢组学筛选差异代谢物常用综合以下3种指标：P值是否小于0.05；变化倍数（Fold Change，FC）是否大于1.5或者2；VIP值是否大于1。上述阈值设定都是常用值，不是固定值。比如FC，有些文章设定为1.2或者2.5。对于差异代谢物较多，3个指标可以混用（文章数据常见满足其中2个指标），同时提高筛选标准，比如FC阈值可以由1.5提高到2倍，P值设定为0.01等。此外，可以从代谢通路角度出发，对较多的差异代谢物进行通路富集分析，筛选变化突出的代谢通路，观察代谢物在某一条代谢通路上的上下游关系以及变化特点，从而有利于进行后续试验验证。