结直肠癌（CRC）每年影响着全球超过25万人的健康状况。大多数散发性CRC由形成的息肉状腺瘤进而发展成粘膜内癌（高度异常增生性腺瘤），之后恶化，该过程被称为腺瘤致癌顺序，它涉及多步特定突变反应。肠道生态系统的改变与人类健康及CRC等疾病的变化有关。粪便宏基因组学是量化肠道菌群的有利工具，具有潜在的诊断价值。而肠道代谢物如氨基酸和细菌代谢物（如胆汁酸和短链脂肪酸），也与肠道癌变相关。因此，联合宏基因组学和代谢组学对肠道环境相关变化进行关联分析可诠释CRC发展过程。日本东京工业大学Takuji Yamada科研团队对来大队列CRC样本进行了粪便宏基因组和代谢组学研究，获得不同阶段CRC特异性表型的微生物和代谢标志物，相关成果发表于《Nature Medicine》。

粪便宏基因组学和代谢组学分析

根据肠镜和组织学检查结果将受试者分为9组：（1）正常（无显著的结肠镜检查变化）；（2）少量息肉（< 5 mm息肉，最多两个）；（3）多发性息肉样腺瘤伴低度异型增生（MP，超过3个腺瘤，多为5个以上腺瘤）；（4）粘膜内癌（高度异型增生的息肉样腺瘤），0期CRC（S0）；（5）CRC I期；（6）CRC II期；（7）CRC III期；（8）CRC IV期；（9）正常，有结直肠手术史（HS）。数据分析时，将（1）和（2）合并为健康对照。I期和II期CRC的患者合并为I/II期（SI/II），III期和IV期CRC的患者合并为III/IV期（SIII/IV）。

对616名、406名受试者粪便样本分别进行肠道菌群和代谢组学检测分析，如Fig.1所示。宏基因组结果显示富含Bacteroides的受试者中Prevotella相对丰度低。且616名患者中有118名（19.2％）检测到Megamonas（10个最丰富的菌属之一）丰度较高，但剩余受试者中未检测。欧洲和美国菌群研究中并没有报告过Megamonas为肠道主要菌属，但在一项中国菌群研究中有被报道，表明Megamonas可能是亚洲人群特征菌属。各个阶段CRC的基因组水平都显著高于健康对照。主成分分析（PCA）筛选出所有受试者和251名健康对照中，两个变化最大的菌：Bacteroides和Prevotella，两者是人类肠道肠型的主要贡献者（Fig.1b）。Dirichlet多项式混合模型将616个样品分为四种群落类型，其中一个类型中Prevotella占主要部分。将风险因子（体重指数）、酒精消耗和吸烟史纳入分析，四种群落类型之间不存在显著差异。肠镜检查结果（健康，MP，S0，SI / II或SIII / IV）和肿瘤位置（左结肠，右结肠或直肠）与群落类型不存在相关性。年龄上呈现显著差异分布，以及Prevotella菌群在男性中占主导地位（79.1％）。

代谢组学结果显示，大肠中主要能源物质丙酸盐和丁酸盐是含量最高的两种代谢物。除了丙酸盐和丁酸盐，PCA结果显示二氢尿嘧啶和尿素也存在较大差异（Fig.1b）。癌症阶段、肿瘤位置、性别与代谢物的变化都不存在相关性。

两种显著升高的菌群模式

与健康对照相比，MP、S0、SI/II和SIII/IV样品中的菌群均发生显著改变。在S0、SI/II和SIII/IV组中，在门水平上，Firmicutes, Fusobacteria和Bacteroidetes升高，并随着恶性程度的升高而升高。Fusobacteria菌种的升高至少出现在两个阶段，而Firmicutes和Bacteroidetes中许多菌种的升高都是阶段特异性的。Proteobacteria门仅在MP阶段升高（Fig.2a）。Bifidobacterium属在S0中降低。本研究获得了两种显著升高的菌种模式：第一种模式是早期到晚期一直升高，第二种模式仅在早期阶段升高。第一种模式的特征菌是F. nucleatum (例如, F. nucleatum ssp. Nucleatum），Solobacterium moorei, Peptostreptococcus stomatis，Peptostreptococcus anaerobius, Lactobacillus sanfranciscensis，Parvimonas micra和Gemella morbillorum。第二种模式的特征菌是Atopobium parvulum, Actinomyces odontolyticus, Desulfovibrio longreachensis和Phascolarctobacterium succinatutens。通过实时定量PCR验证了Atopobium parvulum丰度的变化。

本研究还确定了与CRC关联的新物种，其中Colinsella aerofaciens，Dorealongicatena,Porphyromonas uenonis，Selenomonas sputigena和Streptococcus anginosus在SIII/IV中显著升高。与之前的研究一致，Lachnospira multipara和Eubacterium eligens两种产丁酸盐菌显著降低。产硫化物细菌Desulfovibrio vietnamensis，D. longreachensis和Bilophila wadsworthia降低。

此外， 研究还发现CRC不同阶段中细菌复制率出现显著变化，如G. morbillorum, P. micra和P. stomatis细菌复制率显著升高。与健康对照相比， F. nucleatum ssp. nucleatum 和D. longicatena细菌复制率在SIII/IV中显著升高。细菌复制率升高说明物种丰度相对较高，表明这些细菌可能具有代谢活性。值得注意的是S.moorei和C. aerofaciens分别在MP和S0中细菌复制率出现显著升高。由此可见，许多菌种的改变可能与早期CRC发展有关。

CRC中胆汁酸显著升高

与健康对照相比，有65种代谢物至少在一个阶段呈现显著差异，尤其是胆汁酸、短链脂肪酸、氨基酸和中心碳代谢与肠道菌群密切相关（图2c）。与健康对照组相比，MP中DCA（脱氧胆酸盐）浓度显著升高；S0中甘氨胆酸盐和牛磺胆酸盐浓度显著升高；支链氨基酸，苯丙氨酸，酪氨酸，甘氨酸，丝氨酸浓度也升高。异亮氨酸是由亮氨酸细菌发酵产生的支链脂肪酸，从S0到SIII / IV期浓度逐渐升高。由于MP中DCA升高，作者试图找出与其相关的物种。B. wadsworthia是MP中唯一与DCA显著相关的物种（图2d）。在其他阶段为不显著正相关。已知B.wadsworthia在含有牛磺胆酸盐的培养基中生长，牛磺胆酸盐是DCA前体胆酸盐的共轭形式。

Atopobium parvulum促进产硫化氢的菌群生长

鉴于Atopobium parvulum在MP和S0中显著升高，已报道炎性肠病患者中Atopobium parvulum与链球菌的高度共存关系成为产硫化氢菌的网络中心。分析结果显示，在S0中，与Atopobium相关的细菌数量（属和种水平）显著升高（Fig.2e，f）。Atopobium parvulum 和 A. odontolyticus、S. anginosus、S. moorei、G. morbillorum之间存在很强的相关性，它们的相对丰度在S0和后续阶段均升高。Atopobium在CRC早期阶段的显著升高表明，它可能对产硫化氢的菌群产生强烈影响。

pheC 是CRC-S0阶段的标志物

与健康对照相比，基于KEGG数据库筛选出1243个同源基因（KO基因）在至少一个阶段显著升高，96个KO基因在至少一个阶段显著降低。因为粪便氨基酸浓度从S0开始出现显著变化（Fig.2c），通过分析菌群基因丰度以研究菌群在氨基酸代谢中的作用及菌群丰度变化（Fig.3a，3b）。

在差异最显著的通路中，芳香族氨基酸代谢和产硫化物的通路与CRC相关。参与苯丙氨酸和酪氨酸合成的基因显著升高，其中pheC被确定为区分S0患者和健康对照的得分最高标志物（Fig.4b）。在分解代谢通路中，参与苯丙氨酸降解的基因通过有毒苯乙酸盐的产生而在MP中升高。参与色氨酸合成的基因在SIII / IV中显著降低。负责产生基因毒性硫化氢的异化型亚硫酸盐还原酶亚基A（dsrA）在SIII/IV中显著升高（Fig.3b）。dsrA在许多硫酸盐还原菌（如Desulfovibrio piger）中具有活性，而且这些菌群在SIII / IV中也很高。

构建随机森林和回归模型

大多数S0患者可以通过内窥镜方法治愈，而且被发现的机率很大。为了探讨肠道宏基因组和代谢组学参数作为诊断标志物的潜力，通过构建随机森林和LASSO逻辑回归模型来区分健康对照与S0和SIII/IV。仅基于菌种、KO基因、代谢物及三者组合构建了四种模型。分析结果发现组合模型在S0和SIII / IV的分类上优于单个模型（Fig.4b，c）。S0和SIII / IV 期CRC患者的随机森林ROC面积分别达到0.78和0.85。

在S0分类中，特征值是KO基因，包括编码环己二烯基脱水酶的pheC。其他特征值包括D.longreachensis，S.moorei，亮氨酸，缬氨酸，苯丙氨酸和琥珀酸（Fig.4b）呈现差异分布（Fig.2b，c）。在 SIII / IV分类中，特征值为口腔厌氧菌如P. micra, P. stomatis, F. nucleatum 和 P. anaerobius，之前已被确定为CRC的标志物（Fig.4b）。

CRC手术前后的粪便宏基因组分析

对28名CRC患者（SI / II和SIII / IV）术前和术后1年的粪便样品进行宏基因组测序。结果显示，肿瘤切除后， P. stomatis, P. anaerobius, P. micra, P. uenonis 和 D. longicatena的相对丰度降低（Fig.4d，e）。与健康对照相比，HS（有结直肠手术史）患者的粪便样本中这5个物种丰度无显著差异（Fig.4f）。本研究得到的主要结果如Fig.4a所示。

小结

本研究将有遗传性或疑似遗传性疾病的个体排除，以9组不同阶段CRC（MP, S0, SI/II, SIII/IV, HS）病例作为研究对象，获得了两种升高的菌群模式，其中Atopobium parvulum和Actinomyces odontolyticus只在MP和/或S0阶段显著升高的第二种模式是本研究关注的重点，因为可能是肠道菌群状态的改变使得个体易患CRC。Atopobium parvulum已被证明是产硫化氢菌的网络枢纽，但需要进一步的研究来阐明这些细菌促成肿瘤发生的确切机制。在MP阶段，DCA显著升高，已报道DCA会导致DNA损伤和突变升高。动物研究发现胆汁酸会导致肠道中肿瘤发生率升高。B.wadsworthia的生长受胆汁的刺激，是本研究中唯一与DCA显著相关的物种。已报道B.wadsworthia会引起炎症，但B.wadsworthia与癌症发生相关的研究未见报道。本研究获得了S0阶段的宏基因组学和代谢组学标志物，并且从CRC发展的早期阶段就发现了宏基因组组和代谢组的变化，这具有病原学和诊断意义。虽然尚不清楚这些肠道菌群和代谢物是否直接导致肿瘤发生，但肠道菌群的结构性变化可能导致致癌微环境的变化。由此可见，CRC不仅是一种遗传疾病，也是一种菌群疾病。

参考文献

Yachida S et al., Metagenomic and metabolomic analyses reveal distinct stage-specific phenotypes of the gut microbiota in colorectal cancer. Nat Med. 2019  doi: 10.1038/s41591-019-0458-7.

精彩回顾

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