膳食纤维被称为人体必需的“第七营养素”“绿色清道夫”，它主要分为能够抵抗发酵的不溶性纤维和容易被肠道细菌代谢的可溶性纤维两大类。据研究报道，可溶性纤维–菊粉具有减少脂肪和改善血糖控制等有益的代谢调控作用，它在结肠中由肠道微生物发酵成短链脂肪酸(SCFA)。SCFA在哺乳动物生理学中发挥着重要作用，是肠道上皮细胞的能量来源，促进抗炎调节性T细胞的分化。肠道微生物群将膳食纤维代谢成有价值的营养物质，但肠道微生物群失调则会对宿主不利导致慢性炎症。例如Toll样受体5（TLR5，鞭毛素受体）缺陷小鼠容易发展成明显的微生物依赖性结肠炎及代谢综合征相关的低度炎症，TLR5缺失(T5KO)小鼠的微生物群清除可以改善炎症反应并纠正代谢异常，而将其微生物群移植到无菌野生型(WT)小鼠体内则再现了代谢综合征的表型。

基于上述研究背景，美国托莱多大学Matam Vijay-Kumar研究团队采用T5KO小鼠设计系列实验探讨“发酵纤维菊粉及其产生的SCFA是否改善T5KO小鼠代谢综合征的同时诱导了胆汁淤积和肝细胞癌(HCC) 的发生”。因为肝细胞癌具有微生物群和发酵依赖性，且并不特异于T5KO小鼠，在其他以富含可发酵纤维的复合饮食喂养的小鼠中同样观察到上述现象，因此提出可溶性纤维和SCFA的有益程度与内环境高度相关性的科学假说，添加精制化可溶性纤维的风险可能远远超过它们本身的益处，相关研究成果发表于国际知名期刊《Cell》杂志。

1. 膳食菊粉改善T5KO小鼠代谢综合征的同时诱发肝功能障碍

已有报道饮食中添加菊粉可以改善低度炎症、胰岛素抵抗和肥胖，假设饮食添加菊粉和其他可溶性纤维（Table S1）能改善T5KO小鼠的微生物群失调，预防代谢综合征。选取四周龄雄性T5KO小鼠和野生型WT小鼠采用由7.5%菊粉和2.5%纤维素组成的开源饮食(inulin-containing diet, ICD)喂养24周，发现ICD小鼠肥胖发生率降低约40%，与代谢综合征（脂肪、血糖、胰岛素抵抗、TG、TC）指数降低存在相关性(图S1B-S1F)，T5KO小鼠嗜食不减，平均食物摄取量仍高于WT小鼠(图S1G)。然而ICD喂养的40%-T5KO小鼠血清中观察到醒目的荧光黄色(图S1H)，究其原因是由于胆红素升高所致，胆红素升高提示胆汁淤积。将ICD喂养的T5KO小鼠分为高胆红素组（HB）和正常胆红素组（NB），两组小鼠血清乳酸脱氢酶(LDH)均升高(图S1K)，只有HB小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶升高(图S1L-S1N)。另外，肝脏解毒功能指标血清马尿酸盐和对氧合酶1 (PON1)活性在NB中升高，在HB小鼠中降低(图S1O和S1P)，HB小鼠血清白蛋白降低也提示肝功能受损(图S1Q)。

2. 延长T5KO小鼠ICD喂养时间，加重高胆红素血症和黄疸性肝癌

ICD喂养WT和T5KO小鼠6个月后， 40% T5KO小鼠和0% WT小鼠出现多结节性HCC及血清甲胎蛋白(AFP)升高(图1A-C)。肿瘤为原发性肝脏特异性肿瘤，表现为小梁形态、有丝分裂、红细胞大小不均、细胞肿胀、细胞凋亡、异位淋巴样聚集和非典型胆管形成，肿瘤边界明显丢失和网状结构扭曲(图1D-I ,iii)。肿瘤胆管不典型区域细胞角蛋白-19 (CK-19)表达增加，提示可能累及胆管细胞 (图1I, iv)。HB小鼠在12-14个月时出现死亡，大肿瘤结节横跨整个肝脏 (图1J)。HCC发病率与高胆红素血症(HB 100%，NB小鼠0%)存在强相关性。ICD喂养2周至6个月后，血清胆红素升高，其水平与AFP(图S1R)密切相关，AFP的升高标志着小鼠出现HCC，并表现出肝肿大(图S1S)，肝纤维化(图1G, S1T)和肝细胞过度增生表型(图1I、v和vi)，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3及脂沉积症均在HB小鼠中出现。

3. ICD诱导T5KO小鼠肝癌与肝脏炎症有关，但与TLR4和NLRC4无关

HB小鼠出现白细胞增多(表S2)、血清和肝脂钙蛋白2升高(Lcn2)、脾肿大(图S2A，2C)、中性粒细胞、巨噬细胞和T细胞大量浸润、血清淀粉样蛋白A升高(图S2E)，而NB和WT小鼠肝脏未观察到(图S2D)上述表型，提示T5KO小鼠出现肝脏炎症。此外，HB小鼠模式识别受体(PRR)如Nlrc4, Tlr2在肝脏中的表达明显升高，而Tlr4, Nlrp3仅呈现温和上升趋势(图S2F)。炎症介质Mcp-1, Tnfα, Il17, Cox2等仅在HB小鼠中表达上调，而HB和NB小鼠中Il6均升高(图S2G)。T5KO小鼠自发炎症是由其他PRR的代偿性上调引起的，如TLR4和NLRC4。作者进一步研究T5KO小鼠Tlr4基因缺失是否可以减轻ICD诱导的肝癌。T5/Tlr4双敲除(DKO)小鼠喂养ICD后，其肝脏肿瘤的外显率(36%)及形态与T5KO小鼠观察到的肝癌并无明显区别。ICD喂养的T5/Nlrc4- DKO小鼠检测结果也提示Nlrc4的缺失不具有任何保护作用。

4. HCC可由可溶性纤维果胶和FOS诱导，但不能由不可发酵或不可溶性纤维纤维素诱导

为了阐明其他类型的可溶性纤维是否能促进肝癌发生，将ICD的菊粉替换为果胶 (果胶饮食[PCD], 表S1)。喂养6个月后，15只PCD喂养的T5KO小鼠中有2只出现HB小鼠的代谢表型，即体重较轻、血清胆红素、ALT、AFP升高，并发展为多结节性肝癌(图2A-2F)。当可溶性纤维组分替换为果糖低聚糖(FOS)时，16只T5KO小鼠中有2只在FOS饮食(FCD) 6个月后H-bili和HCC呈阳性(图2G-2L), 表S1)。虽然PCD和FCD喂养小鼠中HCC发生率低于ICD喂养的T5KO小鼠(40％-50％)，但前者的发病率相对较高，因为这种疾病在小鼠中极为罕见。将可溶性纤维含量降低70%(2.5%菊粉)仍足以诱导肝细胞癌。22只小鼠中有4只H-bili和HCC出现阳性(图2M-2R)。相比之下，T5KO小鼠的饮食中缺乏可发酵纤维并添加10%的纤维素饮食[CCD] (抗发酵)，未发生肝癌(图2S 2V)。而CCD喂养的T5KO小鼠表现出肝脏脂肪变性和代谢综合征指标，与之前观察到的喂食谷物饲料的T5KO小鼠类似。

5. 富含菊粉的HFD诱导WT小鼠发生黄疸性肝癌，加重T5KO小鼠严重程度和外显率

高脂肪饮食(HFD)的摄入也会导致机体代谢失调和代谢综合征，作者提出“富含菊粉的HFD会诱导WT小鼠肝癌发生”科学假设，保留ICD的纤维组成并以致胖高脂饮食(HFD-I)代替基础饮食，喂养HFD-I 6个月后大多数WT小鼠都出现了代谢综合征，41只小鼠中有4只出现了血清胆红素、AFP和ALT升高(图S3A, S3C)。病理组织学显示，在WT HB小鼠中存在小型高分化肿瘤，表现为小梁型、细胞增殖、炎症灶和纤维化(图S3D, S3H)。HFD-I喂养的WT小鼠外显率不完全，且发生率低(10%)。喂食HFD-I而不喂食HFD-纤维素，T5KO小鼠HCC发生率从40%增加到65%(图S3I-S3N)，HCC阳性的T5KO小鼠代谢综合征指标减弱，但血清胆红素、AFP和ALT升高(图S3I-S3K)。与中度HCC的WT HB小鼠不同，T5KO HB小鼠在总体和组织学水平上表现为多结节性HCC(图S3L-S3N)。这些发现表明代谢紊乱在HCC的进展中起作用，尤其在HFD条件下WT小鼠消耗可溶性纤维并诱导HCC形成。

6. HCC易感的T5KO小鼠肠道菌群失调，表现为纤维发酵菌和变形杆菌增多

先天免疫缺陷的一个后果是微生物群组成发生改变。T5KO肠道菌群失调表现为粪便总细菌增加(与WT小鼠相比，NB为2倍，HB为3.5倍(图3A)。通过主坐标分析发现ICD喂养的HB T5KO和NB T5KO、WT小鼠肠道菌群组成存在差异(图3B)。三组间的拟杆菌门和厚壁菌门相对丰度无明显差异，而HB小鼠软壁菌门减少，变形杆菌增多，物种丰富度和α多样性明显降低(图3C, 3E)。在ICD和CCD喂养的T5KO小鼠中也观察到饮食对微生物群落组成的影响(图3F, 3G)。线性判别分析效应量(LEfSe)在ICD喂养的HB、NB和WT小鼠中发现753个细菌类群发生了差异改变。LEfSe分类学分析显示梭状芽孢杆菌主要将HB与其他类群得以区分(图3H, 3I)。此外，还发现变形杆菌门与H-bili、人类肝癌的发生有关。

不同饮食(ICD, PCD, FCD)可溶性纤维的结构差异从而导致不同的代谢产物产生。盲肠内容物代谢物分析结果显示，T5KO小鼠ICD和CCD组乙酸盐水平相当，T5KO小鼠PCD和FCD组乙酸盐水平升高(图S4A)。所有WT和T5KO组盲肠中丙酸盐水平相似(图S4B)。与CCD喂养的T5KO小鼠相比，ICD喂养的HB小鼠盲肠中丁酸盐明显增强，PCD和FCD喂养的HB小鼠盲肠丁酸盐相对于CCD喂养的T5KO小鼠有适度升高(图S4C)。

7. T5KO小鼠对ICD诱导的肝癌易感性依赖于微生物，可通过共居或交叉培养向WT小鼠传播

为了研究肠内微生物群在ICD诱导的肝癌中的作用，作者将T5KO小鼠与WT小鼠共饲养，使得微生物群通过共食的方式转移。喂食ICD的WT和T5KO小鼠共居可导致两株小鼠6个月内均发生HCC (图4A, 4F)。ICD喂养后交叉培养的WT小鼠肝癌的发生发展(图4G, 4L)进一步证实了微生物群在ICD诱导肝癌中的作用。此外，在ICD喂养的T5KO小鼠中，使用广谱抗生素进行微生物消蚀可以减轻HCC(图S4H S4K)。经过抗生素处理的T5KO小鼠中，只有1 / 12的小鼠血清胆红素、甲胎蛋白、谷丙转氨酶(ALT)略有升高，且未见肿瘤。此外，无菌T5KO小鼠经ICD喂食后既没有H-bili，也未见HCC(图4M-4P)。这些结果提示长期喂食ICD后菌群紊乱对于 HCC发生发展是必须的，并且这种致癌菌群可向易感宿主传播。

8. 长期接触丁酸盐可促进肝细胞增殖和肝纤维化

纤维发酵代谢物中，丁酸盐具有抑制和促进细胞增殖和肿瘤发生的作用。5mM的丁酸盐对小鼠肝细胞系具有细胞毒性，低剂量0.05 mM具有有丝分裂作用，促进肝细胞增殖(图S4L, S4M)。乙酸盐或丙酸盐在此浓度下对肝细胞增殖无影响。将饮用水中加入100mM丁酸盐给T5KO小鼠饮用9个月，54%的小鼠显示H-bili、肝脏炎症、肝纤维化和肝癌标志物上调，却未见肿瘤(图S4P-S4Z)。由丁酸盐致瘤作用不足提示，ICD诱导的肝癌可能需要其他代谢物或因素刺激，可能是PRR配体或胆汁酸代谢异常，仍需进一步研究其作为HCC发病机制的“二次打击”作用。接下来研究ICD喂养小鼠的肝脏蛋白质组学和代谢组学。蛋白质组学分析显示HB肝脏中各种蛋白质的变化趋势，其中Lcn2在HB小鼠肝脏中上调，反映肝脏炎症，肿瘤抑制蛋白质甘氨酸N-甲基转移酶在肝脏中表达下调。代谢物水平，HB小鼠还表现出芳香氨基酸、乳酸、胆碱、牛磺酸、谷氨酰胺和三甲胺- N -氧化物(TMAO)升高，肝黄素单加氧酶3表达增加等肝代谢组改变的特征。

9. 抑制微生物发酵可以保护T5KO小鼠免受ICD诱导的肝癌的侵袭

基于菊粉发酵促进肝癌的假说，接下来作者通过在ICD中添加甲硝唑抑制菊粉发酵探索肝癌的发病率能否降低。结果可见甲硝唑处理的T5KO小鼠盲肠丁酸盐水平降低(图5A)，在ICD喂养6个月后HCC发生率降低，但肝癌表型并未完全消除(图5B, 5E)。进一步测试植物β酸（来自啤酒花）抑制细菌发酵是否可以降低ICD喂养小鼠的HCC。用20ppm剂量的β酸处理ICD喂养的T5KO小鼠，可以降低盲肠丁酸盐水平(图5F)，但不会影响肠道细菌负荷。此外，接受20ppmβ酸和ICD的T5KO小鼠均未出现HCC，β酸以剂量依赖性方式降低HCC发病率(图5G, 5J)。最后研究ICD引发的肝癌是否可以通过从饮食中去除可发酵纤维而得到终止。在ICD喂养2周时通过血清胆红素指标鉴定出肝癌前期小鼠，这些HB小鼠要么继续ICD喂养，要么6个月后转入CCD治疗。当ICD喂养的HB小鼠发展为明显的HCC时，那些被转入CCD的小鼠却得到了充分的保护，并显示出血清胆红素、ALT和AFP的显著下降(图5K 5O)。这些结果提示ICD喂养小鼠长期暴露在可溶性纤维微生物发酵的环境中会诱导肝细胞癌的发生。

10. 在ICD喂养的T5KO小鼠中，HCC开始于胆汁淤积、肝细胞死亡和中性粒细胞炎症

本研究收集所有HB小鼠血清进行回顾性分析，证实ICD喂养后胆血症总是伴有胆汁淤积。ICD喂养2周后，与NB和WT小鼠相比，HB小鼠血清总胆汁酸(TBA)升高了10倍(图6A)。代谢组学分析显示，给予ICD 4周的HB小鼠血清中初级和次级胆汁酸均升高(图6A)。然而HB小鼠的粪便胆汁酸水平显著降低或检测不到(图6A, i-xiv)。HB和NB的肝胆汁酸差异不显著，但HB小鼠的肝胆汁酸水平有适度升高的趋势(图6B, i-iii)。ICD喂养4周后，HB小鼠肝脏Cyp7a1、Cyp8b1(经典途径)表达升高，Cyp27a1、Cyp7b1(替代途径)表达降低(图6C, 6D)。在HB小鼠中，肝细胞摄入以及基因编码的微管和基底外侧的转运体所需的基因表达受损（图6C和6D）提示其血清TBA升高可能是由于“渗漏/溢出”进入全身循环所致，而不是通过胆囊分泌到十二指肠。回肠中主要胆汁酸转运体上调(图6E)，可能是为了补偿胆囊排空缺陷。此外，RNA测序显示T5KO HB小鼠肝转录组发生了显著变化。

假设TBA升高可能是HB小鼠肝功能障碍的基础(图7A-7D和S5A-S5C)。体外实验发现次生胆汁酸存在的情况下丁酸盐会导致肝细胞死亡(图S4N和S4O)，持续使用丁酸盐治疗9个月的T5KO小鼠中，54%表现出胆血症(图S4U)。HB肝脏TUNEL染色显示接近门脉三联征的区域出现大量细胞凋亡(图7E-7G)。ICD喂养4周后，这种不成比例的凋亡反应伴随着趋化剂（KC、sICAM-1）和中性粒细胞浸润肝脏程度的增加(图7H 7J、S5J、S5U)。过氧化物酶、弹性蛋白酶和肝细胞活性氧(ROS)水平升高(图7K-7M)也可能导致肝损伤。此外，肝丙二醛升高(图7N)、血清和尿8-羟基-2’-脱氧鸟苷升高(图7O)所反映的DNA损伤表明HB肝脏呈现更多的氧化应激(图7N)。ICD喂养4周后炎症反应以中性粒细胞为主，肝脏CD8+T细胞增多，HB小鼠出现逐渐明显的肝炎症和纤维化(图S5U S5X)。ICD喂养可导致胆汁淤积、胆汁过多、肝细胞损伤，从而诱导炎症和代偿性细胞增殖，最终导致肝癌。

小结

膳食可溶性纤维通过肠道细菌发酵成短链脂肪酸(SCFA)，被认为具有广泛的保健作用。因此，消耗这些纤维可以改善代谢综合征。然而，将可溶性纤维菊粉加入到一种复合规定的饮食中，可诱导黄疸性肝癌。菊粉诱发胆汁淤积、肝细胞死亡和肝中性粒细胞炎症逐渐进展到肝癌。抑制发酵或减少发酵菌可显著降低肠道SCFA，预防HCC的发生。干预胆碱以防止胆汁酸的再吸收也对这类肝癌具有保护作用。因此，处理富含可发酵纤维的食物时应特别小心，因为它可能使HCC的风险增加。

在本研究中发现微生物群失调、SCFA和胆汁酸代谢失调以及肝脏炎症在促进肝癌中存在潜在协同作用。ICD喂养HCC小鼠的过程中出现了几个关键的“特征”: (1)细菌总负荷增加，(2)物种丰富度和多样性丧失，(3)变形杆菌增多，(4)梭菌等纤维发酵菌明显富集，(5)次生胆汁酸在体循环中不典型升高。在任何饮食干预之前的T5KO小鼠中，变形杆菌的富集已经很明显，T5KO小鼠最终发展为ICD诱导的肝癌。许多研究已经观察到菊粉和SCFA的抗肿瘤作用，然而生物失调、胆碱血症和炎症的环境中大量丁酸盐的产生，从而形成一种肿瘤促进微环境，其有害作用可能超过其有益作用。综上所述，易出现菌群失调的小鼠长期食用富含发酵纤维的食物会导致肝癌，而减少产丁酸细菌、抑制肠道发酵、从饮食中排除可溶性纤维、防止胆汁酸肝肠循环的干预措施等都是减轻ICD诱导的肝癌的可行策略。未来的研究需要从肠道发酵的“有益”和“有害”两个方面进行，从而为个性化安全使用可发酵纤维，促进人类健康铺平道路。

参考文献

Vishal Singh et al., (2018), Dysregulated Microbial Fermentation of Soluble Fiber Induces Cholestatic Liver Cancer, Cell, DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.09.004