9月7日，麦特绘谱特邀上海市第六人民医院—况俊良博士，为大家带来《猪去氧胆酸治疗非酒精性脂肪性肝病的作用机制》的线上报告分享。感谢各位老师们的积极参会与热烈讨论！现将整场课程的回放视频公开，供大家学习和重温。

课后答疑环节老师们探讨了诸多问题，况博为大家一一作了解答，现将相关内容整理如下，方便大家翻阅。

【Q1】 请问下最开始是如何聚焦到胆汁酸谱的呢？

【A】1. 课题刚开始设计了NAFLD人群和healthy人群的血清代谢物profiling（Q300代谢芯片），结果出来后做了一些数据分析（PLS-DA，PCA等），发现很多差异代谢物都聚焦在胆汁酸部分；

2. 基于课题组很多前期研究结果（ref1-3）；

因此，我们就关注到了胆汁酸代谢，开展进一步的探索和研究。

[1] Sang C, et al. Bile Acid Profiles Are Distinct among Patients with Different Etiologies of Chronic Liver Disease. J Proteome Res. 2021 May 7;20(5):2340-2351.

[2] Xie G, et al. Conjugated secondary 12α-hydroxylated bile acids promote liver fibrogenesis. EBioMedicine. 2021 Apr;66:103290.

[3] Jia W, et al. Targeting the alternative bile acid synthetic pathway for metabolic diseases. Protein Cell. 2021 May;12(5):411-425.

【Q2】 胆汁酸合成的替代途径是受到肝脏的FXR调控？还是肠道FXR，您是如何理解的？

【A】这是个挺好的问题，我们目前认为替代途径是受到肝脏和肠道信号的共同调控。胆汁酸的合成本身就是一个比较复杂的过程，合成酶受到多种转录因子的调控。

胆汁酸的合成途径虽然占正常胆汁酸合成的比例比较低，但是近些年越来越多的研究也发现其在代谢性疾病中的重要作用。

【Q3】经典途径和替代途径的两个产物有改善NAFLD的代谢益处吗？

【A】经典途径和替代途径本身就是主要合成两种胆酸即cholic acid 和chenodeoxycholic acid，本身经典途径产生的CA是肠道内乳糜微粒的主要组成部分，因此CA偏向于更好的促进肠道内脂质吸收。近些年越来越多的研究也发现，12OH胆汁酸（主要是CA）与血糖紊乱之间具有很强的正相关性。而CDCA作为FXR最强的激动剂，相对来说，与CA相比，具有一定的有益代谢的作用。

【Q4】HDCA是胆汁酸，肠道中胆汁酸丰富的地方应该是回肠，为什么检测的是HDCA干预后的盲肠内容物呢？

【​A】回肠和盲肠内容物的胆汁酸都做了检测，虽然胆汁酸是在回肠末端重吸收入血，但是其发生去结合以及次级代谢是在回肠下面的位置。而且平行的宏基因组测序是取的盲肠内容物样本（盲肠的菌群总量和丰富度相较于回肠末端比较高，而且变化趋势也是基本一致的，所以就用了盲肠内容物），为了和菌群位置一致，后续主要分析了盲肠内容物的胆汁酸谱。

【Q5】怎么确定HDCA的给药剂量？HDCA的溶解性不太好，HDCA在干预小鼠时，如何更好地溶解呢？

【A】1. 給药剂量：动物实验上，一开始做了个几个浓度梯度的摸索，从药效和毒性的角度综合评估，最终确定100mg/kg是最优剂量。

2. HDCA配制：如果是用于动物实验，HDCA在偏碱性的溶液条件下溶解性会增强，实验主要用6%碳酸氢钠，加超声溶解，每次用之前都要加热超声。

【Q6】请问PPAR通路是怎么找到的呢？

【A】1. 首先，我们对HDCA干预后的小鼠肝脏，进行RNA-seq

2. 进一步，我们将测序数据中的转录因子部分单独筛选出来，进行统计分析

3. 结合KEGG数据库，将RNA-seq数据中的功能通路进行分析，综合确定被HDCA影响最大的通路是PPAR通路

【Q7】HDCA和PD菌的关系怎么发现的？

【A】1. 我们首先是在HDCA干预后小鼠盲肠内容物的宏基因组测序数据中发现，其丰度显著上升（HDCA/HFD约50倍），并且PD菌的qPCR实验也印证了这个结果。

2. 我们就猜想，HDCA或者还有其他胆汁酸，会不会对PD菌产生直接的影响？因此，我们就做了体外培养PD菌，培养基中添加胆酸的干预实验。

【Q8】PD这个菌培养有什么注意事项吗？

【A】PD不是极度厌氧菌，对氧气不算特别敏感。保证其在厌氧环境中即可。培养基配制参考了ATCC Medium: 2107 Modified Reinforced Clostridial

【Q9】麻烦问下非酒精性脂肪肝小鼠模型造模的时候怎么尽量保证模型小鼠的均一性呢？

【A】1. 首先，可以从相关文献或者实验室之前的实验基础中确定好合适的造模时间

2. 其次，每批动物造模时，可以额外多设置几组，用于在不同造模时间点处理，进而取材从肝脏组织形态或者代谢的角度评判模型是否成功。

【Q10】如何构造合适NAFLD模型才能更好的反映实验效果以及人体中病变的实际情况？为什么用CDA造模急性的NAFLD模型，CDA除了时间短有什么优势呢？

【A】其实本身在人上的NAFLD表型也是具有较大的差异，NAFLD人群有胖（obese-NAFLD）有瘦（lean-NAFLD）。目前，国际比较公认的最常用的是40%脂质、20%果糖的高脂饲料，最能模拟人的疾病进展过程，缺点是造模时间过长。CDA HFD能在比较短的时间出现肝脏纤维化，模拟lean-NAFLD人群。因此，我们认为NAFLD研究需要将不同阶段不同类型的NAFLD模型纳入进来，以模拟临床人群。

【Q11】HDCA对NAFLD的改善是否有通过对炎症反应改善的参与？

【A】在原文figure3中放了一张图，就是HDCA干预后，对肝脏炎症因子合成相关基因的qPCR分析。发现HDCA对肝脏炎症和纤维化有一定程度上的缓解。至于是如何影响作用的，需要我们后续的探索。

【Q12】如果我想研究肠道菌群，收集小鼠排除来粪便或盲肠内容物哪个比较具有代表性，取材的时候怎么减少操作或环境菌群的污染？

【A】如果在不处死小鼠的前提下，想看看肠道内菌群变化，肯定是粪便。但最好是收集跟研究部位相关的内容物，毕竟每个肠段的菌群差异还是很大的，从十二指肠往下，菌群的数量和丰富度是越来越大的（受胃酸和胆酸的影响，还有肠壁生理结构的差异）。我们之前是做过每个肠段内容物的宏基因组测序，发现盲肠内容物菌群丰富度和总量都是比较高的，且和我们研究的胆汁酸代谢高度相关，就选择了盲肠内容物。

至于取材的时候如何减少环境菌污染，可以将器械提前高温灭菌，取材的时候，把垫板、器械酒精消下毒，再就是在相对洁净的环境下取材，这样后续测序结果去除环境和宿主基因组的时候，也会相对容易些。

【Q13】离体实验，HDCA干预肝细胞会改善NAFLD吗？

【A】离体实验，我们分离肝原代细胞后，进行PA诱导的高脂细胞造模，然后用不同浓度的HDCA进行干预，我们并没有看到其会直接改善表型。

【Q14】HDCA治疗NAFLD的作用机制是HDCA独有的吗？

【A】在本项研究中，发现HDCA具有很强的治疗NAFLD的作用，至于其他胆汁酸是否也具有治疗作用，这个有待后续探索。基于胆汁酸及其类似物开发的药物，目前已有很多进入了临床试验，相信也肯定不止HDCA这一种胆汁酸具有治疗NAFLD的作用。

【Q15】如何确定肠道γ-亚麻酸可以进入肝脏发挥作用的？

【A】本研究用γ-亚麻酸灌胃干预动物后，去测定其在肠道、肝脏的浓度，来简单表征其可以通过肠道进入肝脏发挥作用。

【Q16】后续有对代谢物进行功能验证吗？

【A】我们有对γ-linolenic acid进行动物实验验证，发现其能够下调肝脏CYP7A1的水平，其次，肝脏表型也有一定程度上的缓解。