富马酸水合酶（FH）为三羧酸（TCA）循环的一种代谢酶，已被确定为真正的肿瘤抑制因子。FH的缺失会导致富马酸的积累，进而激活一系列致癌级联反应驱动恶性转化和肿瘤进展，如遗传性平滑肌瘤病和肾细胞癌综合征相关性肾细胞癌（HLRCC）。然而，当在肿瘤或其他细胞模型中进行分析时，这些信号级联已经同时被激活交织在一起，其发生过程尚未梳理清晰。

基于此，德国科隆大学Christian Frezza以及英国剑桥大学Christian Frezza等研究人员合作在Nature（IF：69.50）发表一篇题为“Fumarate induces vesicular release of mtDNA to drive innate immunity”的研究。该研究通过建立一个可诱导的小鼠模型来研究肾脏FH缺失所引发事件的时间顺序，综合运用非靶向代谢组学、转录组学和质粒构建等多种方法，最终揭示了富马酸通过诱导mtDNA囊泡释放以驱动先天免疫诱的新机制。

图1. 富马酸诱导免疫反应的机制

Fh1的缺失触发了细胞自主的先天免疫反应

构建他莫昔芬诱导的Fh1^fl/fl小鼠，发现与对照小鼠（Fh1^+/+）相比，Fh1^fl/fl小鼠可有效切除Fh1外显子3和4（Fh1^−/−）。非靶向代谢组学结果显示，FH的缺失带来显著的代谢变化，主要表现在第5天时Fh1^−/−成年小鼠肾脏中的富马酸、S-（2-琥珀酰）半胱氨酸（2SC）等代谢物的异常积累。HE染色结果提示，诱导后第10天的Fh1^+/+和Fh1^−/−小鼠肾脏之间没有明显的形态差异。

进一步对诱导后第10天的小鼠肾组织进行转录组学分析，结果显示干扰素刺激基因（ISG）增加，转录本Ifi202b上调，这与促炎细胞因子和趋化因子的上调有关。通路富集结果同样揭示了最普遍的改变生物过程与参与炎症和先天免疫反应的途径有关。

图2. 成年小鼠肾脏中Fh1的缺失会引发早期炎症反应

为了证实该表型的细胞自主性，从Fh1^fl/fl小鼠肾脏中分离并生成上皮细胞系（iFh1^−/−CL29或iFh1^−/−CL33），发现用4-羟基他莫昔芬（4-OHT）处理后的两种细胞内Fh1的转录和蛋白水平的时间依赖性降低，并伴随着线粒体膜电位和呼吸的降，以及富马酸、2SC和精氨琥珀酸的积累。随后研究炎症激活的相关途径，结果观察到IRF3和下游效应子STAT1的时间依赖性磷酸化，伴随着STING的上调和iFh1^−/−克隆中ISGs转录增加。整体表明Fh1的缺失触发了细胞自主的先天免疫反应，导致体内和体外的ISG上调。

图3. Fh1的缺失触发了细胞自主的先天免疫反应

Fh1的缺失诱导胞质mtDNA释放

研究进一步发现，伴随着Fh1表达的缺失，含有胞质DNA病灶的细胞数量随时间增加，并与线粒体形态的进行性重塑（肿胀和拉长）相吻合。透射电子显微镜（TEM）分析发现Fh1缺陷肾脏和人类FH缺陷型细胞系出现类似的线粒体超微结构异常。随后使用ddPCR定量技术发现iFh1^−/−CL29和iFh1^−/−CL33细胞系的胞质溶胶中mtDNA拷贝数随时间增加，验证了DNA病灶的来源可能是mtDNA泄漏到细胞质中的猜想。

为了确定这种表型是否随着时间的推移而保持，基于先前构建的Fh1缺失的慢性模型（cFh1^−/−CL1和cFh1^−/−CL19）开展实验，发现两种细胞系均表现出线粒体形态异常，显示mtDNA释放到细胞质中，STING-TBK1-IRF3级联被激活，ISGs表达上调，而这些表型均可以通过外源Fh1的重新表达得到改善。以上结果表明，Fh1的缺失将诱导mtDNA慢性释放到细胞质中，从而引发持续的炎症反应。

图4. Fh1的缺失诱导胞质mtDNA释放

富马酸盐可复刻Fh1缺失的表型并诱导cGAS和RIG-I的激活

为了验证富马酸是否可能是这种效应背后的主要驱动因素，使用富马酸单甲酯（MMF，富马酸的细胞可渗透衍生物）处理cFh1^fl/fl细胞，发现MMF处理复刻了Fh1缺失的表型影响，包括早期线粒体琥珀酸蛋白的积累、线粒体网络重构、胞质mtDNA释放、TBK1级联激活和ISGs的表达，以及诱导Fh1缺失、2SC和富马酸的标记物的剂量和时间依赖性表达事件。细胞质Fh1的表达部分恢复了耗氧率和富马酸的水平，但仍导致线粒体琥珀化的增加，表明富马酸线粒体水平升高是mtDNA释放的主要原因。用MMF治疗后，琥珀酸盐在SDH缺陷细胞和组织中积聚，而在FH缺陷情况下其积聚的程度要小得多。同样，与MMF治疗相比，用TCA循环衍生的代谢物α-酮戊二酸或2-羟基戊二酸治疗也没有效果。

构建mtDNA缺陷型的iFh1^fl/flCL29ρ0细胞（Fh1^+/+ρ0），以进一步确认mtDNA释放在模型中的作用。结果观察到经MMF处理的Fh1^+/+ρ0细胞没有显示出磷酸化的TBK1（pTBK1）和pIRF3或其他下游ISG的增加，综合表明富马酸盐和胞质mtDNA分别是触发时和随后的刺激的结果。

此外，MMF处理的细胞中细胞溶质cGAS增加，对cGAS进行药理学抑制可以降低iFh1^−/−CL29和cFh1^−/−CL1细胞ISGs的表达水平，对STING进行体内药理抑制也部分挽救了ISGs的上调，表明cGAS-STING通路是体外和体内诱导炎症反应的关键部分。同样，沉默胞质RNA传感器RIGI也降低了iFh1^−/−CL29细胞中的TBK1和IRF3磷酸化水平，同时在MMF处理的细胞中敲除Sting1、Cgas或Rigi可利于TBK1和IRF3磷酸化和ISG表达的恢复。这些结果表明，富马酸盐诱导了cGAS和RIG-I的激活。

图5. 富马酸可诱导线粒体形态的重构和mtDNA的释放

mtDNA依赖于SNX9的MDV释放

使用了cFh1^−/−CL1细胞进行靶向siRNA筛选，以深入了解FH缺乏介导的mtDNA释放机制。在确认了敲低Vdac1、Cgas、Sting1和Rigi不是影响mtDNA的释放的主导因素并排除了核相关蛋白TFAM耗竭在富马酸盐依赖性mtDNA释放中的作用后，通过TEM成像发现了线粒体中突出双膜结合的低密度囊泡（MDVs）。随后证实了沉默SNX9（在MDV释放中发挥了的作用）可显著减少了cFh1^−/−CL1和cFh1^−/−CL19细胞中mtDNA的释放，其缺失也降低了TBK1-IRF3磷酸化的激活，此作用在诱导后第10天和第15天的iFh1^−/−细胞中也得到证实。

显微镜分析经MMF处理的细胞中，含有DNA (TOM20⁻PDH⁺DNA⁺)的囊泡增加，且囊泡中存在TFAM，证实了胞质DNA病灶的线粒体起源。此外，在iFh1^−/−CL29细胞中Fh1缺失后的第3天就存在TOM20⁻PDH⁺DNA⁺ MDVs，而在MMF处理后的Fh1^+/+ρ0细胞没有发现TOM20⁻PDH⁺ MDVs的存在，表明mtDNA的存在对于富马酸引发的MDVs形成是必要的。在MMF处理前沉默SNX9不仅减少了细胞质中mtDNA的释放，还减少了胞质中OM20⁻PDH⁺DNA⁺ MDVs的数量。这些结果表明，富马酸的积累驱动SNX9和MDV依赖的mtDNA释放到胞质中，以触发先天免疫。

图6. mtDNA通过MDV传递到细胞质中

最后调查了这种炎症反应是否与HLRCC患者相关。HLRCC肿瘤与正常组织的基因表达谱的基因集富集分析（GSEA）揭示了慢性炎症反应、先天免疫和DNA传感器通路的激活。qRT-PCR检测到FH缺陷肿瘤中相同的关键标记物上调。进一步评估来自癌症基因组图谱的FH缺陷肾细胞癌（RCC）、SDH缺陷RCC和常见RCC亚型的RNA测序数据集的细胞组成，发现在FH缺陷的RCC中，白细胞的贡献高于正常组织和RCC亚型。此外，还发现FH缺陷的肿瘤组织中白细胞介素-6水平增加，证实了肿瘤组织中存在炎症环境。整体揭示了在小鼠中观察到的与Fh1缺失相关的免疫表型可能与人体组织缺乏FH有关。

图7. 人体肿瘤组织FH缺陷诱发炎症反应

小结

综上所述，本研究以非靶向代谢组的发现为引导，通过构建不同的小鼠和细胞模型探讨了富马酸水合酶缺失引发的代谢水平变化、炎症和先天免疫反应相关途径的改变，揭示了富马酸可介导线粒体网络的重塑、mtDNA释放到细胞质中以及先天免疫反应的激活的新机制。这些发现为我们理解线粒体功能障碍如何影响先天免疫反应提供了新的见解，并为代谢物驱动的免疫病理学研究进一步奠定了基础。

参考文献

Zecchini V, Paupe V, Herranz-Montoya I, et al. Fumarate induces vesicular release of mtDNA to drive innate immunity. Nature. 2023.

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