4月29日绘谱学堂第九期公开课–《谷氨酰胺代谢流在结肠癌研究中的应用》由上海市肿瘤研究所研究员郝宇钧教授主讲。本期公开课主要从癌基因信号转导到肿瘤代谢研究、代谢流技术在多种肿瘤模型中的应用以及限制代谢流的肿瘤靶向治疗三个方面进行了阐述，谷氨酰胺作为三羧酸循环中代谢物的重要来源，可通过谷氨酰胺代谢流来了解结肠癌的病变过程，从而通过限制代谢流来达到结肠癌的靶向治疗。

PI3K/AKT信号通路是肿瘤研究中非常重要的一条信号通路，PI3K基因在许多肿瘤中突变频率很高，那么这个基因突变后会对细胞代谢产生什么样的影响？如何导致肿瘤的发生和发展？会不会让细胞更依赖某一种代谢形式？用小分子抑制剂或者营养剥夺的方式能否达到肿瘤治疗效果？已知两个重要的营养分子：葡萄糖（肿瘤代谢重编程的重要机制之一），谷氨酰胺代谢（在葡萄糖不能进入细胞的情况下，谷氨酰胺可以替代性的成为三羧酸循环的能量来源）。从正常培养基中剥夺葡萄糖或者谷氨酰胺，观察PI3K突变的细胞是否会对缺陷型培养基产生响应，研究发现PI3K突变的细胞会依赖谷氨酰胺，PI3K突变细胞中谷氨酰胺代谢增强，谷氨酰胺进入三羧酸循环为细胞供能。

其次，介绍了代谢流技术在几种肿瘤模型中的应用，包括体外肿瘤细胞、小鼠皮下肿瘤模型、原位种植肿瘤模型以及转基因模型中谷氨酰胺代谢流研究，谷氨酰胺代谢在结肠肿瘤中的代谢流速率明显增强。不同的肿瘤模型会有不同的结果，需要根据自己的实验目的来选择采用什么模型进行研究。

最后，阐述了代谢流在肿瘤靶向治疗中的应用，即限制谷氨酰胺代谢是否能达到靶向治疗结肠肿瘤的目的，研究者用小分子CB-839和AOA处理肿瘤细胞，发现含有PI3K突变的肿瘤细胞对小分子处理都是有响应的，会抑制肿瘤生长；此外，CB-839和一线用药5-FU联合治疗具有很大的协同作用，能够更好地用于肿瘤的靶向治疗。

更多代谢组学研究方法欢迎咨询

Q&A

Q1. 动物模型上的同位素示踪试验，从给同位素到检测需要多长时间？

A1：本研究做谷氨酰胺代谢流是4个小时，但具体研究时间需要进行预实验摸索，当把同位素输进小鼠体内之后，要在不同时间点取血，以监测目标代谢物多久达到平台期，当在血里面浓度能够一直稳定的保持在一个水平时，此时开始往后一般1-2小时或者2-3小时，而目标代谢物到达靶器官则取决于它和血液中物质交换的时间有多长。如果是肝脏等交换丰富的部位，平台期之后1小时左右应该就可以了。而结肠肿瘤部位，交换没有那么迅速，大概2小时进入平台期，因此选择4小时，也就是2小时血液中代谢物水平稳定后再过2小时后取肿瘤样本做检测。

Q2. 谷氨酰胺¹³C代谢流是否需要用无谷氨酰胺的培养基？

A2：是的，不管是¹³C代谢流还是¹⁴N代谢流，用不包含目标代谢物的培养基会取得更好的效果。一般来说在正常地培养细胞过程中，用标记¹³C代替普通¹²C的培养基进行换液，换液之后的时间点，比如换液之后2小时取样或者24小时取样，这取决于研究目的。这种缺陷型培养基可以直接购买到。

Q3. 如何理解前面提到的某些代谢物同位素峰的变化峰度很低的原因是¹³C占有的比例少？

A3：比如说细胞中，如果把¹²C的谷氨酰胺去掉，只加¹³C标记的谷氨酰胺，检测的最终下游代谢物可能只有10%是标记的，那么它的贡献就只有10%。但是做小鼠会有所不同，因为不可能清除血液中正常的谷氨酰胺（正常小鼠血液中0.5-0.6 mM，是含量最丰富的非必需氨基酸）。实际上血液中真正标记的谷氨酰胺只能占所有谷氨酰胺的30%左右，其他70%的就是血液里正常的谷氨酰胺，细胞中可以去除这些，但小鼠血里面是去除不了的，所以只能计算¹³C占该代谢物所有C元素的百分比。而琥珀酸只有10%标记的，其实真正标记的谷氨酰胺能进入体内的只有30%左右，如果把标记的谷氨酰胺变成100%的话，那么就有50%的琥珀酸来自于标记的谷氨酰胺，这里有70% ¹²C标记的背景是没办法清除的。

Q4. N代谢流是否有意义？

A4：有意义的，比如谷氨酰胺，谷氨酰胺很大一部分进入到核苷酸生成途径中，核苷酸生成增强了，也会提供肿瘤细胞生长的优势，如果能寻找到这种变化，也是很有意义的。

Q5. 通过影响谷氨酰胺是否可以筛选抗肿瘤药物？

A5：可以的，筛选药物要有目标的筛选，比如GLS（谷氨酰胺酶），体外表达这个蛋白，然后做筛选。一般要确定靶标，然后针对靶标的特性去设计筛选模式。

Q6. 前处理复杂是指哪些？

A6：时间点的控制和培养基的选择，选择无目标代谢物（如谷氨酰胺）的培养基，需要做很多次的换液，还要在不同时间点收集样本。

Q7. 实验动物给与¹³C谷氨酰胺的注意事项有哪些？

A7：过程中不要杀死老鼠，需要不断监测整个过程，目标代谢物什么时间达到稳定期，还有小鼠的健康状况要基本良好。

Q8. 代谢物变化幅度表征没有很明显的随代谢流的靠后而衰减的现象，如何确定就是这个代谢流导致的而不是其他代谢流导致的？

A8：如下图，TCA循环的代谢流，一般来说衰减现象不是很明显，特别是一些互通代谢流，比如succinate-fumarate-malate这三个之间衰减现象很小，因为它们三个是互通的。如果是谷氨酰胺-谷氨酸-酮戊二酸，会有明显衰减现象，谷氨酰胺-谷氨酸大概有80%是标记的，到下一步就有衰减，即酮戊二酸是70%；再下一步succinate和fumarate差不多50%，这就有明显的衰减；再到下游citrate就是40%，都是有比较明显的衰减现象。

Hao et al., Oncogenic PIK3CA mutations reprogram glutamine metabolism in colorectal cancer. Nature Communications. 2016

Q9. 能否用自然界的同位素做背景抠除？

A9：不能，最好的背景抠除是同样的代谢物用同一台仪器检测，如果用某一台仪器测了正常培养细胞中的某一个代谢物，那么正常来说就有百分之多少是自然界的，每台仪器给出的背景都可能不一样，所以一般情况下，做背景抠除需要自己做一个正常样本去检测，最后用测出来的背景再做抠除。