4月8日绘谱学堂第六期公开课–《代谢组学-肠道菌群相关性分析策略》由麦特绘谱生物信息工程师周迪主讲，本期公开课结合了麦特绘谱技术团队十几年来的肠道菌群&代谢组学相关研究经验，介绍了肠道菌-代谢-宿主互作机制的关联分析研究策略。参加本期课程的老师和同学们认真听讲并踊跃提问与交流。在此，小编特别整理了一份课后Q&A分享给大家，以便您随时温习查阅。

肠道菌群研究被Nature 评为2020年最需要关注的七个研究领域之一。然而，想要深入研究肠道菌对健康的作用机制，必然绕不开菌群代谢物组学，代谢物是连通肠道菌-宿主相互调节的主要媒介。因此，肠道菌-代谢物相关性分析无疑是将两种组学数据关联的一种重要且高效的手段，为揭示肠道菌-宿主共代谢提供生物学依据。

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本期公开课第一部分介绍了常用的相关性分析方法，从数据处理、结果分析、生成可视化图表等角度系统梳理了代谢物-肠道菌数据相关性分析的特点。

第二部分根据绘谱研究团队积累的肠道菌群&代谢组学相关研究经验，对代谢组学-肠道菌群数据相关性分析中常见的问题进行了汇总和解答，讲解了相关分析实验设计和送样选择的注意事项、配对样本的相关性计算方法以及校正后FDR不显著时的应对方法。

第三部分，结合两个具体的实战案例更加直观的展示了相关性分析中的注意事项。案例1引用客户文章演示如何通过代谢组-肠道菌数据相关性分析来提出可能的机制，案例2引用绘谱研究团队文章讲述如何通过代谢组-肠道菌数据相关性分析锁定关键代谢物，推测其在机制中的作用，进而设计实验逐步验证代谢物、肠道菌群的作用机制。

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Q&A

Q1. 关于做代谢组学和肠道菌群相关分析，该方法对检测样本有何要求？

A1：肠道菌群和代谢组学检测的样本推荐来源于同一个体的相同样本类型并确保生物学重复数及同批次收集，例如同一个体的粪便或肠道内容物数据；算法上对样本类型无特定要求，确保样本类型一致性得到的关联分析可以排除样本类型不同造成的误差而使结果更直观且便于解释。同一个个体的血浆（或血清）代谢数据和粪便肠道菌群数据也可以进行相关性分析，只是两者之间的相关性不如相同样本更明显。此外非靶向和靶向定量均可与肠道菌群进行相关性分析，但推荐使用靶向定量的数据更可靠。

Q2. 采用肠内容物进行菌群分析和代谢物检测分别需要多少用量？

A2：为了满足检测需求，菌群分析可以准备300mg，代谢物检测准备100mg。

Q3. 胆汁酸在体内是循环代谢的，如果检测粪便中的胆汁酸的水平，如何收集粪便比较合理？是否需要禁食？

A3：研究中样本收集方案需要保持一致，由于饮食对胆汁酸的扰动比较大，因此收集粪便前都要禁食，避免食物引起影响。目前检测胆汁酸的收样方式主要有两种，禁食后收集某个时间段样本或取24小时的样本，具体要根据实验目的及科学假说来选取，最终要保证样本检测量充足。

Q4. 胆汁酸和肠道菌群选择结肠内容物好，还是盲肠内容物好？两者结果是否差异很大？

A4：如果是小鼠建议选择盲肠，因为盲肠内容物的量可以同时满足菌群和代谢物检测，其他部位样本量较少，样本量少会造成某些低浓度代谢物不易被检测出，另外胆汁酸在回盲部进行重吸收。盲肠内容物和结肠内容物会存在一定差异，就像菌群在不同肠段分布丰度也是不一样的，两个部位都能说明问题，根据研究目的来选择，但要保证所有个体取同一部位。

Q5. 16S测序与代谢物相关分析时，菌群数据选择哪个层次最好？还是每个水平(门到属种)都需要相关分析？ 

A5：一般先选择门+属/种水平进行分析。

Q6. 大鼠实验中肠道宏基因组和肝脏转录组是否可以联合分析，肠道非靶代谢组呢？

A6：从统计方法学上宏基因组、转录组和代谢组数据均可以做多组学联合分析，联合分析是为了多组学数据结果共同指向相同的研究目的，共同说明同一研究问题，因此对联合分析进行结果的整合最为关键。此外，转录组的差异菌可以做一些靶基因预测，预测到的基因、基因功能可与宏基因的结果、宏基因组的功能预测结果进行比较。

Q7. 菌群和代谢相关性分析时，菌群和代谢物都要先归一化以后再进行相关性吗？还是绝对丰度直接进行相关性分析？

A7：菌群和代谢物关联分析时，一般将两组数据集整理成一致的形式，归一化并非关联分析必须的步骤，需要先评估两组数据的一致性，差别不大的时候可以用绝对丰度数据直接做相关分析。

Q8. 菌群-代谢相关分析用什么软件，热图是用R做吗？ 

A8：菌群和代谢物相关分析因处理数据比较繁琐，目前关联分析基于R软件自编程序完成，网络图部分教程请参考麦特绘谱公众号往期推送《代谢网络图四部曲》系列内容。

Q9. partial spearman用什么软件做？

A9：一般采用R包和SPSS就可以完成，我们团队采用R软件进行分析。

Q10. 分析菌群组间差异时，如果组间年龄、性别、BMI都不匹配，应该用什么方法校正？ 

A10：推荐采用偏相关分析对年龄、性别、BMI及其他混杂因素进行校正后再进行菌群组间差异分析。

Q11. 进行代谢物和菌群研究时，患者使用不同抗生素，对结果影响大吗？如何减少这种影响？

A11：不同抗生素对结果有一些影响，因此纳入病例时，一般排除使用抗生素患者，或者排除半年内使用过抗生素的人群入组以便数据结果解释。

Q12. 如果差异代谢物是血浆代谢组筛选的，验证时应该如何给药比较好？采用灌胃还是腹腔注射？

A12：血浆代谢组物是表征循环系统的代谢物，灌胃和腹腔注射在入血及血药浓度达峰时间上有差异，具体给药方式可结合该药物药代动力学、药效学方面文献以及研究目的进行综合考虑。

Q13. 使用差异菌群和差异代谢物进行相关分析，还是使用每个样本所测的所有菌群和代谢物进行相关分析更好？

A13：从统计算法上可以都做，但是数据量本身比较大，推荐先做差异性的。差异菌群和代谢物的关联分析数据量也不小，后续验证的选择也比较多，尚存在假阳性的结果，如果用所有菌群和代谢物数据作相关分析，势必引入更多假阳性结果和关联分析对结果，易造成关联对验证选择上的盲从，此外，还涉及到后面提到的校正后P值可能不显著的问题。

Q14.如果从30个样本里找个17种差异物，但只用其中10例样本做相关性分析，是否需要对10例样本重新筛选差异物？

A14：如果不是样本本身的异常造成结果的不理想不建议选择其中部分来做相关分析。这种情况下，需要比较10例和30例两种情况的差异物一致性高不高，如果不太一致，可能说明这10例样本的代表性不太好，这样得到的关联分析结果可能不太稳健。

Q15. 已知某药物可以调节菌群，也可以调节某代谢物，想探究两者上下游关系，方法除了分别检测不同时间点代谢物的变化和菌群的变化，能不能通过给抗生素和粪菌移植观测代谢物水平？

A15：本次公开课案例二采用轨迹图来研究是菌群调节代谢物还是代谢物调节菌群，结果可见胆汁酸的变化早于菌群的变化，推测代谢物调节菌群，并设计实验验证胆汁酸调节菌群。抗生素和粪菌移植的干预试验观察代谢变化已经是把菌群作为一个“因”来进行验证。

Q16. 如果相关分析结果证明某代谢物与疾病相关菌群有很高的相关性，是不是仍说明不了菌群和代谢物的因果关系？

A16：对，相关性分析起提示性作用，基于此可以先提出假说，后续设计实验进行验证。谁是因谁是果需要通过验证实验来确定，比如添加或剥夺代谢物观察对菌群有何影响，同理，也可以添加菌群或抗生素看对代谢物的影响，不管哪种方式（具体可以参考文献）都应该验证某个因素对疾病发生发展的影响作用。

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